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急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种难治性恶性血液肿瘤。近四十年来,治疗AML的首选标准疗法一直为“7+3”疗法(7天阿糖胞苷+3天柔红霉素),然而绝大多数的患者在治疗后会复发,而且复发后会对化疗药物产生耐药性,这极大地限制了治疗效果。因此,现在迫切需要寻找新药或新疗法来克服化疗耐药并提高AML病人的存活率,这具有重要的理论意义和临床应用价值。目前研究认为,通过靶向DNA损伤应答(the DNA damage response,DDR)是非常有前景的克服化疗耐药的途径之一。其中,细胞周期检验点激酶1(Checkpoint Kinase 1,CHK1)在DDR网络中扮演重要角色。抑制CHK1不仅可以影响DNA复制起始和复制叉稳定性,还可以去磷酸化CDC25而避免其降解或从细胞核中游离出去,这将导致CDC25对CDK1和CDK2的第15位酪氨酸去磷酸化,从而使CDK1和CDK2活化而消除G2/M和S细胞周期检验点,使细胞无法进行DNA修复,导致DNA损伤累积,最终导致细胞死亡。因此,通过靶向CHK1可以有效地克服化疗耐药,从而增强对白血病细胞的杀伤作用。LY2603618是新型的CHK1抑制剂,相比于第一代CHK1抑制剂,LY2603618具有卓越的CHK1选择性,但其在AML中的作用机制还不完全清楚,这是本论文所研究的第一个关键科学问题。首先,我们通过MTT实验检测了LY2603618在AML细胞株及AML患者临床样本中的抗AML活性。结果显示,LY2603618对AML细胞株具有良好的抗AML活性,而且其对初诊或复发的AML患者临床样本细胞具有相似的抗肿瘤活性。但是,实时定量RT-PCR实验结果显示,AML患者临床样本细胞对LY2603618的敏感性与CHK1的转录水平没有相关性。然后,我们证明LY2603618可以通过抑制CHK1使DNA损伤累积,从而导致Mcl-1的蛋白表达水平下降,降低其对促凋亡蛋白的抑制作用,从而诱导AML细胞凋亡。而这些过程都部分依赖CDK活性,因为CDK抑制剂Roscovitine能部分逆转以上现象。ABT-199是Bcl-2选择性小分子抑制剂,具有良好的抗AML活性。但是,在之前的研究中我们发现,Mcl-1的上调是部分AML细胞对ABT-199耐药的关键原因。因此,我们推测将LY2603618与ABT-199联合应用将能有效消除AML细胞对ABT-199的耐药性,从而显著增强其抗AML活性。我们通过将LY2603618与ABT-199联合处理AML细胞和AML患者临床样本细胞发现,LY2603618可以通过消除Mcl-1的上调来增强ABT-199的抗AML活性,有意思的是我们还发现ABT-199也同时可以增强LY2603618诱导的DNA损伤,这将进一步促进AML细胞死亡。这些结果表明,将LY2603618与ABT-199联合治疗AML初诊患者具有很好的前景,因此我们强烈推荐将LY2603618与ABT-199联合进行临床实验来验证该联合疗法对初诊AML患者的疗效。复发是临床医生治疗AML要面对的一个非常棘手的问题,而且绝大多数AML患者在化疗后会复发,并对化疗产生耐药性。到目前为止,对复发AML患者尚没有有效的治疗手段。我们推测,AML细胞在对化疗药物产生耐药性的过程中,可能会变得对S和G2/M细胞周期检验点更加依赖,因此对化疗耐药的AML细胞可能对细胞周期检验点抑制剂更敏感。这是本论文要研究的第二个关键科学问题。为检测上述可能性,我们在体外建立了两株对Ara-C耐药的AML细胞株,HL-60/Ara-C和CMK/Ara-C,并检测了其对CHK1抑制剂LY2603618和MK8776、ATR抑制剂AZ20和AZD6738以及Wee1抑制剂MK-1775的敏感性。有意思的是,HL-60/Ara-C细胞与其母本HL-60细胞相比,对上述细胞周期检验点抑制剂均显著更敏感;而CMK/Ara-C细胞与其母本CMK细胞相比,对ATR抑制剂AZD6738显著敏感,而对其它细胞周期检验点抑制剂趋于更敏感。而且,抑制CHK1可以有效杀伤Ara-C耐药的AML细胞,并引起γH2AX的表达水平增加,使G2/M期细胞减少。LY2603618与AZD6738(ATR抑制剂),LY2603618与MK1775(WEE1抑制剂)这两组药物组合可以协同杀伤Ara-C耐药的AML细胞,并且对正常细胞无毒性作用。综上所述,我们的研究结果证明CHK1在治疗AML过程中起关键作用,通过抑制CHK1可以有效杀伤AML细胞或Ara-C耐药的AML细胞。我们阐明了LY2603618抗AML的作用机制,并证明了LY2603618可以通过抑制Mcl-1的表达增强ABT-199的抗AML活性。最后,我们还证明了在Ara-C耐药的AML细胞中,LY2603618和AZD6738以及LY2603618和MK1775两组药物组合具有协同抗AML的作用。以上结果为临床开发CHK1抑制剂或应用CHK1抑制剂与其它药物联合治疗初诊或复发AML提供了理论和实验依据。