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本文主要从以下几个部分展开论述：
第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建
目的：
本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株，并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。
材料与方法：
1、材料
1.1细胞株：C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞，购自美国Cell Biologics公司。
1.2质粒：在实验前期，课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。
1.3动物：选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）免疫缺陷雌性小鼠，购自Jackson实验室。
2、方法
2.1将成功构建的质粒进行转化和提取，利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。
2.2建立稳定转染细胞株及分组
将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞，共分为8组：p53敲除组（p53-/-组）、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组（p53-/-+c-Myc组）、p53敲除+PTK2过表达组（p53-/-+PTK2组）、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组（p53-/-+c-Myc+PTK2组）以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。
2.3MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。
结果：
1、PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达
与对照组（0.06±0.02）相比，PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比，c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比，p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。
2、基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力
与对照组及其他6组基因修饰细胞相比，p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P＜0.01）。与对照组相比，p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P＞0.05）。
3、基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果
与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比，p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显著增加（P＜0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比，p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。
与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比，p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显著增加（82.67±6.81），差异有统计学意义（P＜0.001）。与对照组相比，其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论：
本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株，并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型，模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程，该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。
第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究
目的：
研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。
材料与方法：
1、材料
1.1细胞株：SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。
1.2质粒：PTK2基因敲除质粒。
2、方法
2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系；采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。
2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株，对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397，进行靶向抑制PTK2活化，对照组为DMSO对照。
2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后，MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。
结果：
1、PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关
PTK2高表达组患者生存期显著低于PTK2低表达组（P＜0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色，与癌旁组织相比，PTK2在卵巢癌组织中高表达。
2、敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后，降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平
敲除PTK2基因，在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果，GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L，作用时间24h。与对照组相比，当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显著，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
3、敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后，降低卵巢癌细胞的增殖能力
与敲除对照组相比，卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显著降低（P＜0.05）。与加药对照组相比，卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显著降低（P＜0.05）。
结论：
PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用；PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力；PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。
第三部分 PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究
目的：
研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。
材料与方法：
1、材料
动物：实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。
2、方法
2.1敲除PTK2基因后，构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型，每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。
2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织，随机分成两组，一组采用GSK2256098治疗（灌胃，75mg/kg/d，每周治疗5天，共4周），另一组采用DMSO进行对照治疗，每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。
2.3统计方法同第一部分。
结果：
1、PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移
与敲除对照组相比，PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显著降低（P＜0.001）。分离肿瘤组织，与敲除对照组相比，PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显著降低（P＜0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移，而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。
2、抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移
与治疗对照组相比，GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显著降低（P＜0.001）。分离小鼠肿瘤组织，与治疗对照组相比，GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显著降低（P＜0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移，而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。
结论：
PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力。
第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建
目的：
本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株，并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。
材料与方法：
1、材料
1.1细胞株：C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞，购自美国Cell Biologics公司。
1.2质粒：在实验前期，课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。
1.3动物：选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）免疫缺陷雌性小鼠，购自Jackson实验室。
2、方法
2.1将成功构建的质粒进行转化和提取，利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。
2.2建立稳定转染细胞株及分组
将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞，共分为8组：p53敲除组（p53-/-组）、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组（p53-/-+c-Myc组）、p53敲除+PTK2过表达组（p53-/-+PTK2组）、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组（p53-/-+c-Myc+PTK2组）以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。
2.3MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。
结果：
1、PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达
与对照组（0.06±0.02）相比，PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比，c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比，p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。
2、基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力
与对照组及其他6组基因修饰细胞相比，p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P＜0.01）。与对照组相比，p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P＞0.05）。
3、基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果
与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比，p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显著增加（P＜0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比，p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与对照组相比，PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。
与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比，p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显著增加（82.67±6.81），差异有统计学意义（P＜0.001）。与对照组相比，其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论：
本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株，并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型，模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程，该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。
第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究
目的：
研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。
材料与方法：
1、材料
1.1细胞株：SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。
1.2质粒：PTK2基因敲除质粒。
2、方法
2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系；采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。
2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株，对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397，进行靶向抑制PTK2活化，对照组为DMSO对照。
2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后，MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。
结果：
1、PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关
PTK2高表达组患者生存期显著低于PTK2低表达组（P＜0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色，与癌旁组织相比，PTK2在卵巢癌组织中高表达。
2、敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后，降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平
敲除PTK2基因，在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果，GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L，作用时间24h。与对照组相比，当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显著，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
3、敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后，降低卵巢癌细胞的增殖能力
与敲除对照组相比，卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显著降低（P＜0.05）。与加药对照组相比，卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显著降低（P＜0.05）。
结论：
PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用；PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力；PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。
第三部分 PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究
目的：
研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。
材料与方法：
1、材料
动物：实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。
2、方法
2.1敲除PTK2基因后，构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型，每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。
2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织，随机分成两组，一组采用GSK2256098治疗（灌胃，75mg/kg/d，每周治疗5天，共4周），另一组采用DMSO进行对照治疗，每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。
2.3统计方法同第一部分。
结果：
1、PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移
与敲除对照组相比，PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显著降低（P＜0.001）。分离肿瘤组织，与敲除对照组相比，PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显著降低（P＜0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移，而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。
2、抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移
与治疗对照组相比，GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显著降低（P＜0.001）。分离小鼠肿瘤组织，与治疗对照组相比，GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显著降低（P＜0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移，而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。
结论：
PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力。