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布鲁氏菌是一种革兰氏阴性兼性胞内寄生菌，能够引起人类和家畜的布鲁氏菌病，通过皮肤黏膜、呼吸道和消化道传播。羊、牛、猪等宿主被感染后，会出现流产和不孕不育等症状，而人则会出现关节炎、睾丸炎、波浪热、多汗等特征。布鲁氏菌感染机体后，能在机体内建立免疫逃避机制。最近研究表明，细菌中存在一类非编码的小RNA(small non-coding RNA，sRNA)，具有潜在的调控细菌代谢以及毒力相关基因作用。本课题组已有的RNA-seq分析预测表明，羊种布鲁氏菌的sRNAAbcR1极可能是具有调控功能的sRNA。 布鲁氏菌的sRNA靶定其mRNAs然后发挥转录后调控作用。通过查阅文献同源性比对以及生物信息学预选定测AbcR1的三个潜在靶基因BMEII0923，BMEII0372，BMEI1250。它们与布鲁氏菌MerR蛋白家族转录后调控、短链脱氢酶的活性、周质蛋白有关。通过RACE实验检测靶基因的TSS位点，测序验证后克隆相关靶基因，然后利用具有绿色荧光GFP报告系统的大肠杆菌质粒检测系统，将sRNA构建到具有氨苄青霉素抗性的质粒载体pZK001上，将备选targets构建到具有氯霉素抗性的质粒载体pXG-10SF上，pXG-10SF上具有superfolder GFP基因，可表达target∷GFP融合蛋白。通过共转化两种质粒得到菌落，检测GFP在特定激发光下的荧光强度;超声波破碎菌体后，Western blot检测GFP蛋白的表达量;qRT-PCR检测靶基因的转录水平，由此推断GFP蛋白的转录和表达情况，从而分析sRNA对于target的调控作用。相关结论如下: 1.TargetRNA2作为专门的细菌sRNA靶位点预测工具，能够用于布鲁氏菌靶位点的分析，例如sRNA AbcR1靶位点的相互作用预测，但预测结果需要更进一步的实验验证。 2.羊种布鲁氏菌Brucella menlitensis的sRNA AbcR1经验证是具有调控功能的非编码小RNA，能够下调靶基因BMEII0923的表达，也能够上调靶基BMEII0372的表达，但对于BMEI1250的调控作用不明显。 3具有GFP的质粒报告系统能够直观快速的反映羊种布鲁氏菌中目的sRNA和潜在靶基因的互作，该报告系统能够用于布鲁氏菌sRNA靶位点的筛选。 实验结果表明，此大肠杆菌质粒报告系统可以用于验证布鲁氏菌sRNA和targets的互作，相比传统的western blot验证和qRT-PCR，具有快速直观的特点。此方法可以便捷的验证布鲁氏菌毒力代谢调控相关的sRNA和对应靶位点的互作，为揭示布鲁氏菌sRNA调控毒力以及代谢的机理提供新的思路。