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目的:本实验通过过表达及干扰慢病毒调控皮层神经元中Netrin-1的表达量,研究Netrin-1对大鼠皮层神经元OGD损伤后神经元的凋亡、突起生长和突触形成的影响以及对ERK1/2通路的激活情况。为Netrin-1对脑缺血的治疗作用提供了可靠的依据。方法:1.行大鼠皮层神经元的体外分离、培养和鉴定。2.取培养至第7 d的神经元行OGD处理90 min,建立OGD损伤模型:24 h后通过光镜和激光共聚焦显微镜观察神经元OGD损伤的情况。3.OGD损伤前后,添加过表达、干扰慢病毒Ntn1、ERK1/2抑制剂U0126。随之分为以下五组:正常对照组（Control组）、OGD模型组（OGD组）、OGD+过表达Ntn1组（OGD+LV-Ntn1组）、OGD+Ntn1干扰组（OGD+LV-Ntn1-RNAi组）、OGD+过表达Ntn1+ERK1/2抑制剂组（OGD+LV-Ntn1+U0126组）。4.各组皮层神经元在OGD损伤后24 h进行如下检测:CCK-8试剂盒检测神经元的活力;LDH试剂盒检测神经元毒性;q PCR检测PSD-95、GAP-43 mRNA的表达量;Western Blot检测p-ERK1/2、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、PSD-95、GAP-43蛋白的表达量;免疫荧光染色,ZEISS LSM 710激光共聚焦显微镜拍照,Image J软件测量最长突起平均长度并计数一级突起数量;Caspase-3试剂盒检测神经元的Caspase-3活性。结果:1.CCK-8检测神经元存活率结果和正常组相比,OGD组明显减低;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组明显升高;然而OGD+Ntn1干扰组明显减低;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组明显低于OGD+过表达Ntn1组。2.LDH检测神经元毒性结果和正常组相比,OGD组显著升高;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组明显降低;然而OGD+Ntn1干扰组明显升高;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组明显高于OGD+过表达Ntn1组。3.q PCR结果各组PSD-95 mRNA的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达显著减少;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达明显增多;然而OGD+Ntn1干扰组的表达显著减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达明显低于OGD+过表达Ntn1组。各组GAP-43 mRNA的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达显著减少;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达明显增多;然而OGD+Ntn1干扰组的表达显著减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达明显低于OGD+过表达Ntn1组。4.Western Blot结果各组p-ERK1/2蛋白的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达明显增多;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达明显增多;然而OGD+Ntn1干扰组的表达显著减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达显著低于OGD+过表达Ntn1组。各组Bax蛋白的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达明显增多;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达减少;然而OGD+Ntn1干扰组的表达增多;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达显著高于OGD+过表达Ntn1组。各组Bcl-2蛋白的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达减少;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达增多;然而OGD+Ntn1干扰组的表达明显减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达明显低于OGD+过表达Ntn1组。各组Cleaved Caspase-3蛋白的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达显著增多;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达明显减少;然而OGD+Ntn1干扰组的表达明显增多;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达明显高于OGD+过表达Ntn1组。各组PSD-95蛋白的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达明显减少;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达显著增多;然而OGD+Ntn1干扰组的表达显著减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达明显低于OGD+过表达Ntn1组。各组GAP-43蛋白的表达情况:和正常组相比,OGD组的表达减少;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组的表达明显增多;然而OGD+Ntn1干扰组的表达明显减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组的表达明显低于OGD+过表达Ntn1组。5.免疫荧光结果免疫荧光染色测量平均最长突起长度结果显示:和正常组相比,OGD组显著减小;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组明显增大;然而OGD+Ntn1干扰组明显减小;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组明显小于OGD+过表达Ntn1组。免疫荧光染色测量平均一级突起数量结果显示:和正常组相比,OGD组明显减少;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组明显增多;然而OGD+Ntn1干扰组明显减少;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组明显少于OGD+过表达Ntn1组。6.Caspase-3活性结果和正常组相比,OGD组显著升高;和OGD组相比,OGD+过表达Ntn1组明显降低;然而OGD+Ntn1干扰组明显升高;此外,OGD+过表达Ntn1+U0126组明显高于OGD+过表达Ntn1组。结论:Netrin-1可以抑制OGD后神经元的凋亡、促进神经突起生长和突触形成,其机制可能是通过激活ERK1/2及调节Bax、PSD-95等表达从而发挥相应的作用。