论文部分内容阅读
目的:筛选寻常性银屑病血热证清热凉血药物敏感基因,并验证其在寻常性银屑病血热证中的细胞生物学机制 方法:采用在体与离体实验相结合,运用Solexa高通量测序技术,Real-timePCR,免疫组化,Western blot等技术,系统观察银屑病“血热证”患者与正常人组织中相关基因、蛋白表达差异,并以正常人血清、银屑病血热证患者血清、含药血清培养的人角质形成细胞HacaT细胞株、人T淋巴细胞Jurkat细胞株为研究对象,以正常人血清、寻常性银屑病血热证患者血清及清热凉血药物含药血清进行细胞培养,采用shRNA干扰技术,造成相关基因沉默,运用流式细胞仪观察细胞凋亡及增殖结果,Real-time PCR技术观察敏感基因mRNA表达水平,Western Blot技术观察敏感基因蛋白表达水平。 结果:89例寻常性银屑病血热证患者经凉血治疗8周后,根据治疗结局分为愈显组(32例)、有效组(47例)、无效组(10例)。运用Solexa高通量测序技术,检测寻常性银屑病血热证患者皮损组织及健康受试者皮肤组织,将差异基因聚焦于PD-1/PD-Ls通路。经Real-timePCR技术验证,结果显示寻常性银屑病血热证患者愈显组皮损组织中CTLA-4mRNA、PD-1 mRNA、PD-L2mRNA高表达(P<0.01),经免疫组化定量分析及Western blot技术验证,结果发现结果显示寻常性银屑病血热证患者愈显组皮损组织中PD-1、PD-L2蛋白高表达(P<0.05)。细胞培养结果发现,转染PD-L1shRNA后,经流式细胞仪检测,各组细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05),含药血清组细胞增殖明显降低,寻常性银屑病血热证患者血清组染空质粒(vector)和转染PD-L1 shRNA后,HacaT细胞增殖率均升高,与不转染干预因素存在显著性差异(P<0.05);清热凉血中药含药血清组与正常受试者组,不转染、转染空质粒(vector)与转染PD-L1 shRNA均存在显著性差异(P<0.05)。 结论:推测PD-1、PD-L2、CTLA-4可作为寻常性银屑病凉血药物治疗的敏感基因,银屑病血热证患者由于皮损处PD-1、PD-L2基因的下调,PD-1/PD-L2结合下降,树突状细胞活化,分泌IL-23,促进T细胞向Th17分化,分泌IL-17,招募炎症细胞到皮损处聚集;另一方面,由于上述基因的缺乏,其负性调控机制受到抑制,导致细胞增殖过度。