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目的前列腺凋亡反应因子4（Prostate apoptosis response-4, Par-4）是从凋亡的前列腺肿瘤细胞中分离出来的一种促凋亡基因,是第一个被证实的WT1（Wilms’tumor suppressor-1）的分子伴侣和抑制因子。WT1基因在各类白血病中异常高表达,而且过度表达的WT1基因与正常细胞恶性转化有关。本实验拟采用荧光定量RT-PCR及Western blotting的方法,首先观察Par-4基因、WT1基因在急性白血病及非白血病患者骨髓细胞中的表达情况,并进一步探讨其在白血病细胞凋亡过程中的表达变化。然后构建人Par-4基因真核表达载体,转染人白血病细胞K562,观察Par-4基因表达对WT1基因表达的影响,进一步研究其对白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期改变等生物学行为的影响。本课题将为白血病的发病机理提供进一步的理论依据,为白血病的基因治疗提供更好的治疗靶点。方法1.荧光定量RT-PCR检测人Par-4及WT1基因在急性白血病患者骨髓细胞中的表达制备Par-4基因、WT1基因及β-actin阳性标准品,建立荧光定量RT-PCR扩增体系。采用荧光定量RT-PCR方法检测78例急性白血病患者及23例非白血病患者骨髓细胞中Par-4、WT1mRNA的表达。同时探讨Par-4、WT1基因表达水平与完全缓解率的关系。2.检测As2O3诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化用不同终浓度三氧化二砷（2-10umol/L）处理K562细胞24-72h,细胞涂片,Wright-Giemsa染色,观察细胞形态学改变,用MTT法测定细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡。采用荧光定量RT-PCR检测Par-4、WT1基因mRNA表达变化,Western blotting检测Par-4和WT1蛋白表达的变化。3.构建人Par-4基因真核表达载体以pDNR/Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因, T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。构建的重组质粒命名为pIRES2-EGFP/Par-4。4.转染Par-4基因对K562细胞WT1基因表达及生物行为的影响用最佳配比的质粒pIRES2-EGFP/Par-4（或pIRES2-EGFP）和转染试剂Superfect的复合物转染K562细胞,分别于转染前及转染后48h,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,流式细胞术（FCM）检测转染效率。经流式细胞仪分选EGFP阳性细胞,荧光定量RT-PCR检测Par-4、WT1mRNA表达水平,Western blotting检测Par-4、WT1蛋白表达水平。pIRES2-EGFP/Par-4转染K562细胞后,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪Annexin-V/PI法检测细胞凋亡。同时设立未转染组、空质粒（pCon）组作为对照。5.人Par-4基因对K562细胞的促凋亡作用研究pIRES2-EGFP/Par-4质粒转染K562细胞48h,加用小剂量（2umol/L）As2O3,MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡。同时设立未转染组、未转染加As2O3组、Par-4质粒转染未加As2O3组作为对照。结果1.急性白血病患者骨髓细胞中Par-4及WT1基因的表达情况荧光定量RT-PCR检测结果示:Par-4基因在78例急性白血病患者与23例非白血病患者骨髓细胞中都有表达,在急性白血病患者表达量明显下降,具有统计学差异（p<0.05 ）。在缓解组Par-4基因表达增强,与初治组和复发组之间有统计学差异（p<0.05 ）,但仍低于正常对照组。初治组和复发组之间表达量无统计学差异。Par-4基因表达水平与CR率无明显关系（p>0.05 ）。WT1基因在急性白血病患者骨髓细胞中高表达,正常对照组WT1基因低表达（p<0.05 ）。在缓解组WT1基因表达下降,与初治组和复发组之间有统计学差异（p<0.05 ）,但仍高于正常对照组。初治组和复发组之间表达量无统计学差异。不同WT1基因表达水平与CR率之间有统计学差异（p<0.05 ）。2. As2O3诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化不同浓度As2O3作用于K562细胞,随浓度增加能明显抑制细胞生长,诱导细胞发生凋亡。同时Par-4基因mRNA表达和Par-4蛋白表达水平逐渐增加;而WT1基因mRNA及蛋白表达逐渐下降。3.构建人Par-4基因真核表达载体经酶切、测序鉴定,pIRES2-EGFP/Par-4真核表达载体构建成功。4.转染Par-4基因对K562细胞WT1基因表达及生物行为的影响4.1 Par-4质粒转染采用1.5μg pIRES2-EGFP/Par-4质粒DNA,DNA与转染试剂SuperFect为1:4的比例转染生长状态良好的K562细胞（2×106/ml）。随着时间的延长,转染效率逐渐增高,在48h达到峰值（75.34±5.84）%,与对照组相比差异具有显著性（p<0.05）。4.2转染Par-4基因对K562细胞WT1基因表达的影响转染48h流式细胞仪分选EGFP阳性的细胞,纯度可达98.0%±1.2%,荧光定量RT-PCR及Western-blotting检测结果显示:与未转染组及pCon组相比, Par-4mRNA及蛋白表达明显增强,而WT1mRNA及蛋白表达水平无明显变化（p>0.05）。4.3 Par-4基因表达对K562细胞增殖、凋亡的影响Par-4基因真核表达载体转染K562细胞后,MTT法检测细胞增殖抑制率,结果显示:转染Par-4质粒及空质粒组K562细胞增殖抑制率与对照组相比,无显著性差异（P >0.05）;经流式细胞仪对EGFP阳性的细胞采用AnnexinV/PI双参数法进行细胞凋亡分析,结果显示:与未转染组相比,转染Par-4质粒及空质粒组K562细胞凋亡率无显著性差异（P >0.05）。5.人Par-4基因对K562细胞的促凋亡作用研究5.1 MTT法检测细胞增殖抑制率结果显示:与未转染组相比,各转染组细胞增殖抑制率无统计学差异（p>0.05）;2μmol/L As2O3作用后,各组细胞增殖抑制率较未加药组逐渐升高,随时间延长差异出现显著性（p<0.05）;Par-4质粒+As2O3组细胞增殖抑制率各个时间点均高于其他各组（p<0.05）。5.2流式细胞仪检测Par-4基因表达对K562细胞周期的影响结果显示:未转染组K562细胞S期细胞比例较高。与未转染组相比,Par-4质粒未加As2O3组及未转染加As2O3组G1期细胞比例略有下降,G2期细胞比例略有上升,但S期细胞无明显变化（P>0.05）;而Par-4质粒+As2O3组G1期及S期的细胞比例明显降低（P<0.05）,G2期的细胞比例明显上升,出现G2/M期阻滞（P<0.05）。5.3 AnnexinV/PI双参数法分析K562细胞凋亡情况结果显示:与未转染组相比,各转染组细胞凋亡率无统计学差异（p>0.05）;2μmol/L As2O3作用后,各组细胞凋亡率较未加药组逐渐升高,随时间延长差异出现显著性（p<0.05）;Par-4质粒+As2O3组细胞凋亡率各个时间点均明显高于其他各组,差异具有显著性（P<0.05）。结论1采用荧光定量RT-PCR的方法证实Par-4基因在急性白血病低表达,而WT1基因高表达,二者成相反的表达模式。Par-4基因表达水平与CR率无明显关系。2高浓度As2O3能明显抑制K562细胞生长,诱导细胞发生凋亡。在诱导细胞发生凋亡过程中,Par-4基因的表达上调,而WT1基因的表达下调。3成功构建了人Par-4基因真核表达载体。4通过采用SuperFect高分子树脂转染试剂,成功介导了Par-4基因在K562细胞中的表达。Par-4基因表达对WT1基因无明显抑制作用,对K562细胞增殖、凋亡无直接作用。5 Par-4基因表达上调可以加强小剂量As2O3对K562细胞的增殖抑制及凋亡作用,引起K562细胞G2/M期阻滞。