背景自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种由免疫耐受缺失导致的慢性肝脏疾病,如果不加以治疗控制,最终可能导致肝硬化。该病在世界范围内均有发生,近年来,国内文献报道的病例数呈明显上升趋势。80%-90%的AIH病人需要采用终身免疫抑制治疗,这很容易产生副作用和类固醇类药物耐受。因此,探索研究AIH复杂的免疫学发病机制,并发现潜在的新颖治疗策略是必要且有意义的。免疫细胞在AIH中有多种作用。其中,树突状细胞(dendriticcells,DCs)是一种重要的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),可以诱导效应性T细胞,B细胞产生免疫反应。它的作用有两面性,DCs趋向于成熟可以启动适应性反应,但未成熟状态下的DCs又能促进免疫耐受。免疫细胞的静悉或活化常伴随着细胞中代谢的改变,代谢增强可使免疫细胞激活。DCs和T细胞的存活、激活和成熟常伴随着细胞线粒体功能增强;糖酵解、脂肪酸合成增加;氧化磷酸化下降等。这些细胞内代谢改变则涉及到一系列受体和受体后信号通路的调控,如过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome prolixferator-activated receptor,PPAR)-γ 通路、AKT 通路、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路等。金线莲(Anoectochilus roxburghii,A.roxburghii)是一种广泛存在于热带、亚热带地区的传统中草药,由于其降糖、保肝等多种药理活性而受到广泛关注。金线莲苷(Kinsenoside,KD)是金线莲的一种重要的活性成分。本实验在此基础上,希望对KD在AIH中发挥的潜在治疗作用及其免疫学相关机制进行初步探讨。目的本研究旨在确定,在AIH发生发展过程中起到关键作用的免疫细胞亚型以及细胞间的相互作用,并探索KD对AIH的治疗作用,阐明KD对AIH疾病过程中免疫内环境和免疫细胞的调控机制及KD可能的作用靶点、信号通路。方法1.AIH小鼠模型的建立和KD治疗作用的评估采用T细胞缺陷裸鼠模型研究T细胞在AIH发生发展中的作用。KD对AIH的治疗作用采用刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导AIH小鼠模型进行评价。通过小鼠肝组织苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色和血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)等肝功能指标检测,评价AIH的严重程度和KD的治疗作用。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测免疫细胞亚群变化。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子分泌情况。2.KD对DCs-CD8+T细胞相互作用的调控本实验采用一种新颖的小鼠AIH模型——DCs负载小鼠肝癌细胞(hepatocellular carcinoma cells,Hepa1-6)接种免疫小鼠诱导 AIH 模型(DC/Hepa1-6),来检测DCs和CD8+T细胞的相互作用。并分别过继转移来自正常、ConA肝炎和给予KD治疗的肝炎小鼠的骨髓源DCs(bone marrow dendritic cells,BMDCs)至健康小鼠脾脏,观察DCs对脾脏CD8+T细胞的刺激活化能力,以及KD的治疗作用。体外实验采用磁珠分选CD8+T细胞,与DCs共培养后,通过混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR),细胞毒实验、DCs提呈抗原能力分析等探索KD对DCs-CD8+T细胞相互作用的调控以及可能机制。3.KD对免疫细胞的代谢调控KD对免疫细胞代谢影响的相关研究通过检测DCs,T细胞和DC调控的CD8+T细胞的葡萄糖摄取、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)分泌、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和葡萄糖转运功能来评价。在DCs、T细胞和DC调控的CD8+T细胞中,采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)法检测糖酵解和脂肪代谢相关基因的表达水平,探究KD对免疫细胞糖脂代谢的调控机制。4.KD作用靶点的筛选和对受体后信号通路的调控采用2D药效团指纹筛选(2D fingerprint screen)、3D分子对接(molecular docking)模型分析、生化分析和受体阻断实验筛选KD的靶受体。采用蛋白免疫印迹分析(western blotting)、qPCR 和凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)等,分析KD作用于VEGFR2受体后,对代谢相关PI3K-AKT和炎症相关JAK2-STAT3信号通路相互作用的影响。采用受体拮抗剂、信号分子阻断剂和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制受体和信号通路中信号分子的活性,研究VEGFR2受体和PI3K-AKT信号通路阻断后,KD对DCs的作用情况。在DCs中,采用染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation assay,ChIP assay)检测PI3K-AKT通路下游关键信号分子叉头转录因子O1(forkhead box protein 01,FoxO1)与程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)和趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7)基因启动子区域的结合情况,明确KD抑制DCs激活的具体机制。结果1.KD对AIH有治疗作用,可调控在AIH的发生发展中起到关键作用的免疫细胞,特别是CD8+T细胞和DCs在缺乏T细胞的裸鼠体内,AIH的发生发展受到抑制,表明在AIH中,T细胞的调控至关重要。在ConA诱导的AIH模型中,KD的治疗显著减轻肝脏炎症病理损伤,减少促炎1型辅助性T细胞(Thelpercell type 1,Th1)的分化,血清中促炎因子白介素(interleukin,IL)-2、干扰素-γ(interferon-γ,IFN)分泌下降;提高抗炎Th2型细胞的分化,血清中抗炎因子IL-10和转化生长因子(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)分泌增多。KD的治疗作用与阳性药水飞蓟素(silymarin)相当,与此同时,KD对健康小鼠没有表现出严重的不良反应。在AIH模型中,CD8+T细胞比例上调、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory Tcells,Tregs)分化下降,DCs趋向于成熟,KD的治疗可以显著逆转这些变化,但对其他免疫细胞的调控不显著。在体内或体外,KD均对DCs产生直接调控作用,抑制DCs成熟、迁移和抗原呈递能力。与之相反,KD对CD8+T细胞可能是非直接的调控作用。在体内存在DCs的环境中,KD可抑制CD8+T的分化和功能。小鼠体内清除CD8+T细胞后,KD的作用也不再显著。但是,磁珠分选出CD8+T细胞后进行体外实验,KD既不影响CD8+T细胞的增殖,也不影响它的杀伤作用。2.KD通过DCs介导对CD8+T细胞的作用在DC/Hepa1-6诱导的小鼠AIH模型中,给予KD治疗或采用KD处理后的DCs免疫小鼠,AIH的发病率和严重程度均显著降低,CD8+T细胞的分化和毒性也被抑制。小鼠脾脏过继转移DCs实验结果可见,AIH模型组DCs过继转移,脾脏内CD8+T细胞的比例和细胞毒性较过继转移正常DCs组显著增高,KD处理的DCs过继转移,CD8+T细胞的比例和活性下降。体外实验显示,KD不影响磁珠分选出CD8+T细胞的增殖、分化和杀伤能力,但CD8+T细胞与DCs共培养后,KD的作用得以恢复。这提示在AIH的发生发展和KD的治疗中,CD8+T细胞的激活需要DCs介导。进一步检测DCs和T细胞表面的受体和共刺激信号,结果显示,KD对DCs-CD8+T细胞相互作用的调控,主要是通过上调负性调控因子——PD-L1/程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)的相互作用实现的。3.KD调控免疫细胞的代谢,从而影响其功能KD抑制DCs和DC处理的CD8+T细胞的糖摄取、NEFA分泌和葡萄糖转运体-1(glucose transporter-1,GLUT-1)的表达,也降低了它们的MMP,抑制其线粒体功能。KD作用亦可抑制DCs和DC处理的CD8+T细胞的糖酵解和脂肪代谢相关基因的表达,但对未经DCs处理的T细胞内糖酵解相关基因影响不显著,提示KD可通过重塑免疫细胞,特别是DCs的代谢,下调其活性和功能,从而发挥免疫抑制作用。4.KD 靶向血管内皮生长因子受体 2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2),抑制受体偶联的代谢相关PI3K-AKT和炎症相关JAK2-STAT3信号通路的相互作用KD可嵌入VEGFR2的活性区域,且结合能低,亲和力高,VEGFR2可能是KD的重要靶点。KD处理后,DCs、DC调控的CD8+T细胞和肝靶细胞——肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中 VEGFR2 的表达下降,下游 PI3K-AKT和JAK2-STAT3这2条信号通路中信号分子的表达和磷酸化也随之下调,但KD对其他受体和通路影响不大。进一步的研究发现,KD抑制免疫细胞,肝组织和靶细胞细胞膜上磷酸化VEGFR2(p-VEGFR2)的表达。采用VEGFR2特异性拮抗剂阻断此受体后,KD的作用也被相应地阻断。对信号通路中其他可能靶点,如janus酪氨酸蛋白激酶2(janus kinase 2,JAK2)进行阻断,却不能削弱KD的作用,进一步证明VEGFR2可能是KD的作用靶点。KD可下调代谢相关PI3K-AKT和炎症相关JAK2-STAT3信号通路中信号分子的表达和磷酸化,上调JAK2-STAT3信号通路中负性调控因子——信号转导抑制分子 3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的表达。KD 亦可逆转 PI3K特异性激动剂740 Y-P引起的PI3K-AKT和JAK2-STAT3信号通路的活化。EMSA等实验也发现,STAT3作为介导VEGFR2和JAK2的重要的转录因子,KD的作用可抑制其DNA结合活性和二聚化,抑制p-STAT3的转录入核。因此,STAT3可能作为代谢相关PI3K-AKT通路和炎症相关JAK2-STAT3通路产生cross-talk的关键节点,来调控KD作用于VEGFR2后的信号转导。当脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激DCs活化成熟时,PI3K-AKT信号通路下游重要信号分子FoxO1与DCs内CCR7基因启动子区域的结合能力显著升高,与PD-L1基因启动子区域的结合显著降低,KD作用可逆转FoxO1对DCs中CCR7和PD-L1基因启动的调控,从而抑制DCs的迁移和抗原提呈能力。5.KD的药代动力学和成药性初步预测最后,我们对KD的药代动力学和成药性进行了初步预测,比较KD与其差向异构体Goodyeroside A在药理活性上的差异。结果显示,KD药代动力学稳定,具有较好的成药性,在免疫调控方面的药理活性明显优于其差向异构体。结论综上所述,我们明确了 KD靶向VEGFR2,调控免疫细胞内代谢相关PI3K-AKT和炎症相关JAK2-STAT3信号通路的相互作用,抑制DCs内CCR7基因的启动、促进PD-L1基因的高表达,进而调控DCs的成熟与功能。KD下调DCs与CD8+T细胞的能量代谢、上调DCs-CD8+T细胞负性共刺激分子PD-1/PD-L1的相互作用,干扰DCs对CD8+T细胞的刺激活化,在AIH中发挥免疫抑制作用。