论文部分内容阅读
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs)是一类由2个及2个以上苯环或戊环构成的多环类碳氢化合物的总称,是一类重要的环境和食品污染物,在大气、水、土壤等环境中普遍存在。有研究显示,PAHs可引发胃癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等疾病,同时破坏免疫系统、神经系统,并导致内分泌紊乱。动物实验表明,PAHs可诱发多种癌症,并造成机体的损伤。由于PAHs对人和动物危害较大,并且普遍存在于环境当中,已越来越多地受到人们的重视。因此,开展对PAH快速检测技术研究尤为重要。目前,常见的检测方法包括细胞检测法、薄层扫描法、分光光度法、气象色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、二极管矩阵检测法等。但是应用仪器分析和细胞检测方法需要较复杂的前期处理、较高的成本以及技术性较强专业人员,不利于检测方法的推广应用。而免疫学检测方法拥有特异性强,灵敏度高,操作简便,成本低等优点,可迅速对大量实际样品进行检测。本研究在制备芘和萘的免疫抗原、检测抗原和单克隆抗体基础上,分别建立了芘和萘的间接竞争ELISA方法、胶体金免疫层析方法、免疫荧光定量PCR方法(Real-time immuno-PCR,RT-IPCR)和改进型RT-IPCR方法,为快速检测PAHs含量奠定基础。本文应用活脂法,将半抗原芘和萘分别连接至载体蛋白,制备检测抗原OVA-芘、OVA-萘和免疫抗原BSA-芘、BSA-萘,应用非变性凝胶电泳和紫外全波长扫描法鉴定偶联成功。将免疫抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞、腘淋巴结细胞和Sp2/0细胞融合,筛选杂交瘤细胞,获得2株可分泌芘单克隆抗体和萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。芘单克隆抗体和萘单克隆抗体亚型分别为IgG1和IgG3,亲和力常数分别为3.23×109L/mol和4.17×108L/mol,效价分别为1:2.56×106和1:3.2×105。利用制备的芘和萘的单克隆抗体,分别建立相应的间接竞争ELISA检测方法,同时对检测方法进行条件优化。芘间接竞争ELISA最低检测限为65.08pg/mL,检测范围为117.16pg/mL~3986.97pg/mL,实际样品平均回收率为98.7±1.3%。萘间接竞争ELISA最低检测限为2.0ng/mL,检测范围为3.78ng/mL~172.33ng/mL,实际样品平均回收率为96.1±1.8%。制备直径为20nm的胶体金溶液,分别于芘和萘的单克隆抗体偶联形成探针,透射电镜和紫外全波长扫描结果显示胶体金探针制备成功。组装简易试纸条后对各项参数进行优化。芘试纸条裸眼检测范围为10ng/mL~50ng/mL,萘试纸条检测范围为25ng/mL~125ng/mL,在4℃真空干燥条件下,试纸条至少可以稳定保存8周。实际水样品加标回收实验表明,制备的胶体金试纸条性质稳定,可应用于实际样品。利用芘和萘单克隆抗体,分别建立相应的免疫荧光定量PCR检测方法,同时对条件进行优化。芘RT-IPCR检测范围为100fg/mL~1ng/mL,实际样品平均回收率为98.6±4.1%。萘RT-IPCR检测范围为10pg/mL~10ng/mL,实际样品平均回收率为96.7±6.4%。利用芘和萘单克隆抗体,分别建立相应的改进型RT-IPCR检测方法,同时对条件进行优化。芘改进型RT-IPCR检测范围为1pg/mL~1ng/mL,实际样品平均回收率为96.9±4.8%。萘改进型RT-IPCR检测范围为100pg/mL~100ng/mL,实际样品平均回收率为97.4±4.9%。利用气谱-质谱联用法(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer,GC-MS)分别建立萘、茐、菲、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[a]芘和茚并[1,2,3, cd]芘的标准曲线,确定最低检测限,将获得结果与前述建立的免疫学方法进行比较分析。结果表明,与GC-MS法相比,间接竞争ELISA法、RT-IPCR法、改进型RT-IPCR法灵敏度提高数十倍至数千倍。综上所述,本文制备了芘和萘的单克隆抗体,并分别建立了间接竞争ELISA法、胶体金试纸条法、RT-IPCR法和改进型RT-IPCR法。同传统的GC-MS法相比,成本较低,灵敏度有不同程度的提高,可针对不同检测要求,选择应用。