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喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,其全世界发病率呈逐年增长趋势。目前喉癌的治疗方法主要是手术治疗,虽然人们一直致力于对喉癌早诊断、早治疗,并在切除癌肿的前提下,尽可能保留或重建喉的功能,但是,患者术后仍有不同程度发音障碍和吞咽困难,影响到患者生存质量。为了改善疗效及提高预后的生存率,尽管人们不断探索喉癌发生、发展机制,但喉癌发生的分子机制尚不明确。microRNA(miRNA)是一类存在于生物体内非编码单链小分子RNA,长度约为21-25个核苷酸,它们通过碱基互补配对方式与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)完全或不完全结合,导致靶基因mRNA降解或翻译抑制,从而调控靶基因的表达。目前研究认为,miRNA通过类似癌基因、抑癌基因或其他方式的作用对细胞生长、凋亡和细胞周期调控,导致肿瘤发生发展。我们前期通过miRNA芯片技术筛选到了一系列在喉癌中表达差异的miRNA,如：miR-106b、miR-151-3p、miR-19b、miR-185、miR-139-5p等。后期我们通过荧光定量PCR进一步研究发现miR-106b在喉癌中显著性表达。因此,本研究以miR-106b为研究对象,揭示其在喉癌发生发展中的作用。第一部分miR-106b在喉癌组织中的表达研究目的研究miR-106b在喉癌、癌旁组织中表达水平。方法提取14例配对喉癌手术新鲜标本(喉癌组织和癌旁组织)RNA,用茎环实时荧光定量PCR法检测niR-106b在喉癌和癌旁组织中表达水平。结果喉癌组织中miR-106b表达水平较癌旁组织显著增高。结论miR-106b在喉癌组织中高表达,推测niR-106b可能与喉癌发生发展有关。第二部分niR-106b对喉癌细胞增殖、侵袭和体内生长能力的影响目的研究miR-106b对喉癌细胞体外增殖、侵袭和体内生长能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测转染miR-106b ASO后,Hep-2和TU-212喉癌细胞miR-106b表达水平,采用体外克隆形成实验、细胞侵袭实验和体内生长实验观察miR-106b对Hep-2和TU-212喉癌细胞增殖和侵袭能力影响。结果转染了miR-106b ASO的Hep-2和TU-212喉癌细胞其miR-106b表达水平降低了约80%,抑制niR-106b表达可以降低喉癌细胞体内外生长和体外侵袭能力。结论miR-106b在喉癌细胞株中高表达,而抑制其表达可以部分逆转喉癌细胞体内外生长和体外侵袭能力。第三部分miR-106b靶向调控RUNX3的研究目的研究miR-106b是否可以直接靶向调控RUNX3。方法生物信息学方法筛选RUNX3的候选miRNA,荧光素酶报告基因实验检测候选miRNA对RUNX3的调控作用,Western blot检测转染了miR-106b模拟剂和抑制剂的喉癌细胞中RUNX3蛋白表达变化,采用荧光素酶报告基因实验验证miR-106b对RUNX3直接调控作用。结果预测的RUNX3上游的11个可能调控性miRNA,荧光素酶报告基因实验显示共转染miR-130b、miR-106b mimics和RUNX3-3’UTR能够显著降低报告质粒荧光素酶的活性,其中miR-130b能够直接靶定RUNX3在胃癌细胞中已有报导。因此,我们进一步研究rmiR-106b的作用。转染miR-106b ASO的喉癌细胞中RUNX3蛋白表达水平升高2-3倍,转染miR-106b mimics的喉癌细胞中RUNX3蛋白表达水平降低约40%～70%。荧光素酶报告基因实验显示niR-106b功能被ASO减弱后,含有野生型RUNX3-3’UTR报告质粒荧光素酶活性显著增强,转染miR-106b mimics后,报告质粒荧光素酶活性显著降低,而miR-106b mimics和miR-106b ASO对含有突变型RUNX3-3’UTR的报告质粒的荧光素酶活性则无显著影响。结论RUNX3为miR-106b的靶基因。第四部分喉癌中niR-106b靶向调控RUNX3作用机制研究实验一喉癌中RUNX3基因启动子甲基化及其蛋白表达的研究目的研究RUNX3基因启动子甲基化状态及其蛋白表达与喉癌发生发展的关系。方法采用Western blot检测RUNX3在喉癌组织中的表达水平。用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测RUNX3基因启动子甲基化发生状况。用Western Blot检测RUNX3蛋白在RUNX3启动子甲基化喉癌组织、RUNX3启动子非甲基化喉癌组织和正常喉上皮中的表达情况。免疫组化检测正常喉上皮组织、癌旁组织、RUNX3启动子甲基化喉癌组织和RUNX3启动子非甲基化喉癌组织中RUNX3的表达情况。结果RUNX3启动子甲基化发生率约为41.67%,无论RUNX3启动子是否发生甲基化,RUNX3在喉癌组织中均低表达。结论除RUNX3基因启动子甲基化在喉癌发生发展中起重要作用外,可能还有其它机制如miR-106b的调控引起喉癌的发生发展。实验二研究RUNX3在喉癌细胞中的作用目的过表达RUNX3,研究RUNX3在喉癌细胞中的作用方法构建过表达RUNX3的pCMV6/RUNX3,Western blot检测pCMV6/RUNX3质粒转染Hep-2和TU-212喉癌细胞后RUNX3蛋白表达水平,MTT实验、克隆形成实验和Transwell侵袭实验观察pCMV6/RUNX3质粒转染细胞后生长曲线、增殖和侵袭能力变化。结果过表达RUNX3后,喉癌细胞生长侵袭能力明显下降。结论上调RUNX3表达可以抑制喉癌细胞的生长、增殖和侵袭能力。实验三miR-106b靶向调控RUNX3在喉癌细胞中作用机制目的研究miR-106b通过靶向调控RUNX3对喉癌细胞功能的影响。方法向喉癌细胞株中同时转染RUNX3-siRNA和ASO-miR-106b,使得miR-106b和RUNX3的表达同时下调,Western Blot检测RUNX3表达水平,实时荧光定量PCR法检测mR-106b表达水平,克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测细胞增殖和侵袭能力变化。结果喉癌细胞转染ASO-miR-106b+siRNA Control的增殖和侵袭能力显著低于转染ASO-miR-106b+RUNX3siRNA组,证明RUNX3siRNA能够部分挽救ASO-miR-106b对喉癌细胞的生物学功能影响。结论miR-106b通过靶向作用RUNX3参与喉癌的发生。