目的： 研究苦瓜蛋白对子宫内膜癌Ishikawa H细胞体外增殖、凋亡及对细胞内PI3K/AKT信号转导通路的影响，以探讨苦瓜蛋白体外抗子宫内膜癌作用机制和应用价值，以期为子宫内膜癌的中医药治疗提供实验依据。 方法： 1.苦瓜蛋白的提取及鉴定。 2.体外培养子宫内膜癌Ishikawa H细胞，用不同浓度的苦瓜蛋白(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)进行干预，设立空白对照组，应用细胞活性计数方法(Cell Counting Kit-8，CCK-8法)检测不同浓度苦瓜蛋白作用不同时间(24小时、48小时、72小时)对Ishikawa H细胞体外生长的影响。 3.倒置显微镜下观察Ishikawa H细胞经苦瓜蛋白作用引起的形态学变化。 4.流式细胞仪测定不同浓度的苦瓜蛋白(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用48小时、72小时对Ishikawa H细胞周期分布的影响。 5.采用琼脂糖DNA凝胶电泳检测不同浓度的苦瓜蛋白(0μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)对Ishikawa H细胞作用72小时后的凋亡DNA，同时采用Annexin V-FITC法和TUNEL法检测20μg/ml苦瓜蛋白作用72小时对Ishikawa H细胞早期凋亡率及晚期凋亡率的影响。 6.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度苦瓜蛋白(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用72小时和20μg/ml的苦瓜蛋白作用不同时间(0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h)对Ishikawa H细胞内磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylation AKT，P-AKT)、蛋白激酶B(protein kianse B，AKT)表达量的影响，同时设立空白对照组(不加苦瓜蛋白)和阳性对照组(1μmol/l PI3K抑制剂wortmannin作用1小时)。 结果： 1.苦瓜籽经丙酮梯度沉淀得到的苦瓜籽粗蛋白，经假配基亲和层析后浓缩得到了部分纯化的中间提取物，将此中间提取物通过葡聚糖凝胶G-75凝胶层析柱，利用分子排阻的原理将不同分子量的蛋白分开。经凝胶层析后得到了4个较为明显的吸收峰，取各个峰及其总蛋白峰洗脱液进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝G-250染色得到了一条分子量约为30KD的条带。无细胞系统中峰4对蛋白质生物合成抑制活性测定：IC50=5.3×10-10mol/L。 2.CCK-8法检测苦瓜蛋白对Ishikawa H细胞体外生长的影响结果： (1)20μg/ml的苦瓜蛋白作用24小时、48小时、72小时后细胞生长抑制率分别为37.93％，55.90％，81.58％。 (2)不同的浓度(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用72小时后细胞生长抑制率分别为31.04％，39.46％，40.26％，58.84％，77.85％，81.58％。利用曲线拟合计算在72小时，苦瓜蛋白对Ishikawa H细胞生长的IC50为1.86μg/ml。 可见，随着作用时间延长和浓度的增加，苦瓜蛋白对细胞的生长抑制率也增大，时间和浓度有交互作用(F=15.949，P<0.01)，20μg/ml苦瓜蛋白作用72小时对细胞的生长抑制率最大。 3.倒置显微镜下可见经苦瓜蛋白作用后Ishikawa H细胞出现形态改变，数量减少，有部分细胞皱缩变小，颗粒增多，并可见细胞碎片。 4.流式细胞仪对细胞周期分布测定结果： (1)不同浓度的苦瓜蛋白(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用Ishikawa H细胞48小时后G1/G0期细胞比例逐渐减少(F=106.866，P<0.01)，而S期细胞比例逐渐增加(F=99.686，P<0.01)，G2/M期细胞比例无明显变化(F=2.223，P=0.163)。不同浓度的苦瓜蛋白(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)作用Ishikawa H细胞72d，时，G1/G0期细胞所占比例减少(F=238.272，P<0.01)，S期细胞所占比例增加(F=742.190，P<0.01)，G2/M期细胞比例无明显变化(F=2.221，P=0.153)。 (2)20μg/ml的苦瓜蛋白作用Ishikawa H细胞72d，时较作用48d，时对细胞周期影响更显著，G0/G1期比例减少(t=13.393，P<0.01)，S期细胞比例增加(t=6.862，P<0.01))G2/M期细胞比例无明显变化(t=1.716，P=0.161)。 所以，苦瓜蛋白能使Ishikawa H细胞阻滞于S期，S期细胞比例增多和G0/G1期比例减少呈明显的时间和浓度依赖性，对S期细胞增多和对G1/G0期细胞减少的作用，时间和浓度存在交互作用(F=13.612，P<0.01；F=21.786，P<0.01)，且在20μg/ml苦瓜蛋白作用72d，时，S期细胞增多和G1/G0细胞减少作用最显著。 5.不同浓度的苦瓜蛋白(0μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)对Ishikawa H细胞作用72小时，琼脂糖DNA凝胶电泳可见阶梯状凋亡DNAladder。 6.Annexin V-FITC法和TUNEL法测定细胞凋亡结果显示20μg/ml的苦瓜蛋白作用Ishikawa H细胞72小时的早期凋亡率和晚期凋亡率分别为16.07±0.15％，17.58±0.60％，提示苦瓜蛋白能诱导Ishikawa H细胞发生凋亡。 7.Western blot结果显示子宫内膜癌Ishikawa H细胞为PTEN基因表达缺失的细胞株，不同浓度的苦瓜蛋白作用Ishikawa H细胞72小时P-AKT/AKT的表达量，差异有统计学意义(F=975.995，P<0.01)。随着浓度的增加，P-AKT/AKT的表达量呈下调趋势，且在10μg/ml、20μg/ml的苦瓜蛋白处理后引起P-AKT/AKT的下调作用与阳性对照PI3K抑制剂wortmannin作用相当。20μg/ml的苦瓜蛋白作用Ishikawa H细胞不同时间P-AKT/AKT的表达量比较差异有统计学意义(F=286.582，P<0.01)，随着作用时间的延长，P-AKT/AKT的表达量呈逐渐减少的趋势，在12小时时抑制作用已达到最强。 结论： 1.经假配基亲和层析和凝胶过滤层析相结合的纯化的方法可以得到较高纯度的苦瓜核糖体失活蛋白。 2.子宫内膜癌Ishikawa H细胞经苦瓜蛋白处理后，细胞生长受到抑制，随着时间延长和浓度增加，细胞生长抑制率增大。 3.苦瓜蛋白能诱导Ishikawa H细胞凋亡的发生。 4.苦瓜蛋白使Ishikawa H细胞发生细胞周期阻滞，阻滞于S期，表现为S期细胞增多，G1/G0期细胞减少。 5.苦瓜蛋白抑制Ishikawa H细胞的生长，诱导其发生凋亡，可能与抑制Ishikawa H细胞内AKT的磷酸化有关，提示苦瓜蛋白抗肿瘤作用与抑制肿瘤细胞内PI3K/AKT信号转导通路有关，且验证了PI3K/AKT信号转导通路的激活参与了PTEN基因表达缺失的子宫内膜癌的发生发展。