非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指非酒精所致(每日饮酒量小于10克),以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。随着人们饮食结构、生活方式的改变,其发病率在全球范围呈逐年上升趋势。NAFLD疾病谱随病程的进展而表现不一,包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化甚至肝细胞癌,大部分患者仅为单纯性脂肪肝,也简称为“脂肪肝”。脂质合成增多、脂肪酸代谢和运输障碍、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应、肠道菌群失调、线粒体功能异常等是导致NAFLD发生发展的重要机制,而其病理基础是肝细胞脂肪变性。当肝脏脂质合成增加和细胞内游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平升高,超过了脂肪酸的利用(β氧化能力)及极低密度脂蛋白(VLDL)的输出水平时,过多的甘油三酯(TG)聚集,进而导致肝脏中脂质沉积形成肝细胞脂肪变性。正常情况下,由乙酰辅酶A从头合成产生的TG仅为总合成TG的5%,在病理状态下,肝细胞脂质从头合成产生的TG可以达到三分之一。因此,脂质从头合成增多是导致NAFLD脂质沉积的重要机制。在真核细胞中,内质网是负责蛋白质合成、折叠、加工、转运及其质量监控的重要细胞器。在缺氧、高脂等环境时,内质网中未折叠或是错误折叠蛋白增多,激活细胞的保护性措施未折叠蛋白反应(unrolded protein response,UPR),当适应性机制仍不能有效清除未折叠或错误折叠的蛋白,超出负荷时则引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS有三条途径分别为PKR样ER调节激酶[pancreatic ER kinase(PKR)-like ER kinase,PERK又称双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶]/真核细胞转录起始因子-2α(eukaryotic initiation factor-2α,e IF-2α)/活化转录因子-4(activating transcription factor 4,ATF-4)通路,肌醇需酶-1[(inositol requiring enzyme-1,IRE-1)又称抑制物阻抗性酯酶-1]/X盒结合蛋白(X-Binding protein-1,XBP-1)和活化转录因子-6(activating transcription factor-6,ATF-6),最近研究发现ERS与糖脂代谢密切相关,可能是导致NAFLD脂质沉积的重要机制。随着上世纪70年代高果糖玉米糖浆(HFCS)引入食品加工业后,含果糖的食品和软饮料摄入量增加,临床和动物研究发现高果糖摄入与人群的肥胖、血脂异常、代谢综合征、NAFLD相关。由于高脂饮食是已知的导致NAFLD的重要诱因,我们课题组之前采用高果糖或高脂饮食喂养大鼠,结果发现二者均可诱发肝内脂质沉积和高甘油三脂血症,也证实短期(1周)和长期(16周)高果糖喂养均可诱导出小鼠NAFLD模型,出现肝脏脂质沉积,增加了小鼠肝脏内源性脂质合成率,促进脂质从头合成,上调参与脂质从头合成的上游调控因子固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)和碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein,Ch REBP)及三个关键酶乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和硬脂酰Co A脱饱和酶-1(stearoyl-Co A desaturase-1,SCD-1),高脂饮食也可以引起肝脏脂质沉积,但是对脂质从头合成的影响则与高果糖饮食相反,并且高果糖饮食导致ERS出现,因此前期的动物实验提示ERS可能介导高果糖诱导NAFLD脂质从头合成增加的重要机制。近来已有大量的文献证实了果糖可以导致脂肪肝,并且发现应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)或牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholate,TUDCA)可以改善肝脏脂质沉积,单独应用内质网诱导剂可以导致细胞TG升高,而另有研究发现高脂环境可导致ERS,因此ERS和脂质从头合成之间的相互关系及果糖促脂质从头合成增加的始动机制尚不明确。动物研究发现敲低PERK小鼠可避免高脂环境诱导的NAFLD,敲低XBP-1可以改善小鼠脂肪肝。可是由于动物研究存在多种干扰因素,目前的研究尚缺乏细胞水平的对ERS单条通路在高果糖诱导NAFLD作用机制中的研究。因此,本研究首先应用高果糖(fructose)或高棕榈酸(palmitic acid,PA)培养Hep G2细胞,观察细胞甘油三酯(TG)含量、细胞脂质沉积,其次观察了果糖和棕榈酸对脂质从头合成的影响;再分别应用两种ERS抑制剂和两种ERS诱导剂,观察ERS对脂质从头合成的影响,探讨ERS对脂质从头合成的影响;最后分别利用细胞转染的方法靶向上调和下调PERK/e IF-2α/ATF-4通路中的ATF-4和IRE-1/XBP-1通路中的XBP-1,观察单条通路对肝细胞脂质合成的影响,从而在体外细胞水平研究高果糖饮食对脂代谢的危害,探讨ERS中单条通路在NAFLD发生机制中作用。第一部分果糖和棕榈酸对Hep G2细胞脂质从头合成中的不同影响目的:探讨果糖和棕榈酸(palmitic acid,PA)对Hep G2细胞甘油三酯的影响及机制,并确立高果糖造成NAFLD的细胞模型。方法:采用普通培养基和不同浓度(1、5、20mmol/L)果糖培养基培养Hep G2细胞(分别简称为N、F1、F5、F20组),干预不同时间(12、24、48、72h)后观察Hep G2细胞TG水平和脂质沉积,采用GPO-PAP法测定TG,油红O染色反应脂质沉积;再使用普通培养基(N组)、20mmol/L果糖干预72h(简称F组)或0.2mmol/L棕榈酸干预24h(简称PA组),测定各组肝细胞脂质从头合成相关的上游转录因子SREBP-1c和Ch REBP的基因表达水平及三个下游关键酶ACC、FAS和SCD-1的蛋白表达水平。结果:1不同浓度果糖干预不同时间对Hep G2细胞TG水平的影响:应用果糖培养Hep G2细胞12小时,F20组的TG水平明显高于N组,差异有统计学意义(P<0.05),F1和F5组与N组比较,有升高趋势,无统计学意义(P>0.05);培养24小时F20组的TG水平明显高于N组(P<0.01),F5组的TG水平明显高于N组(P<0.05)、F1组有升高趋势,但是无统计学意义(P>0.05);培养48或72小时,F5、F20组的TG水平明显高于N组(均P<0.01),F1组较N组有升高趋势,但是无统计学意义,(P>0.05),提示干预时间相同,TG随果糖浓度增加而增加,呈剂量依赖关系;果糖浓度相同,TG的水平随着干预的时间延长逐渐增加,呈时间依赖关系,20mmol/L的果糖,干预72小时TG达到最高值。2不同浓度的果糖培养Hep G2细胞72小时后对脂质沉积的影响:油红O染色显示N组少见红染,被油红染色的大小不一的脂滴随着果糖浓度增加而增加,F20组红染脂滴最多。3果糖和棕榈酸对细胞TG水平的影响:F和PA组的肝细胞TG均较与N组升高(均P<0.01),两组之间无明显差异(P>0.05)。4果糖和棕榈酸对脂质从头合成上游调控因子和关键酶的影响:F组比N组的肝内Ch REBP基因表达增加1 8倍(P<0.01),PA组无明显变化,F组比N组的肝内SREBP-1c基因表达增加5倍(P<0.01),PA组比N组的肝内SREBP-1c基因表达增加2.4倍(P<0.01),比F组明显降低,有统计学差异(P<0.01);F组比N组的肝内ACC、FAS、SCD-1蛋白表达明显增加(均P<0.05),PA组与N组相比无显著差异。结论:1高果糖培养Hep G2细胞可以引起肝细胞脂质沉积;2肝细胞的脂质沉积程度与果糖的浓度呈剂量依赖性关系,与干预时间呈时间依赖关系,20mmol/L的果糖浓度孵育72小时TG水平达到最高值,肝细胞脂质沉积最明显,确定了果糖的干预浓度为20mmol/L孵育时间为72小时;3高棕榈酸培养Hep G2细胞引起脂质沉积程度与高果糖一致;4高果糖干预比高棕榈酸,明显促进了Hep G2细胞脂质从头合成相关的上游调控因子SREBP-1c、Ch REBP和下游关键酶ACC、FAS、SCD-1的表达水平。第二部分内质网应激对脂质从头合成的影响研究目的:分别使用两种内质网应激抑制剂4-PBA、TUDCA干预高果糖培养的Hep G2细胞,并分别使用两种ERS诱导剂Tunicamycin、Thapsigagin干预Hep G2细胞,观察ERS对肝脏内源性脂质从头合成的影响。方法:首先分别加入两种不同内质网应激抑制剂4-PBA(20mmol/L,简称4-PBA组)、TUDCA(0.2mmol/L,简称TUDCA组)干预高果糖培养基的Hep G2细胞,之后分别加入两种ERS诱导剂Tunicamycin(2μg/ml,简称为Tm组)和Thapsigagin(600nmol/L,简称Tg组)诱导Hep G2细胞;最后利用Western的方法测定各组p-PERK、p-e IF-2α/e IF-2α、ATF-4、p-IRE-1/IRE-1和XBP-1s,测定TG水平和油红O染色观察细胞脂质沉积,检测各组与肝脏脂质从头合成的上游转录因子SREBP-1c和Ch REBP的基因水平,以及下游脂质合成的关键酶类ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平。结果:1观察ERS抑制剂对ERS的影响:F组的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平较N组明显升高(均P<0.01),TUDCA组p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表达下降,差异有统计学意义(均P<0.05),p-e IF-2α/e IF-2α、ATF-4均表达下降,差异有统计学意义(均P<0.01),4-PBA组p-PERK、p-e IF-2α/e IF-2α、ATF-4均表达下降,差异有统计学意义(均P<0.05),p-IRE-1/IRE-1、XBP-1s均表达下降,差异有统计学意义(均P<0.01),两种抑制剂确实减少了PERK/e IF-2α/ATF-4和IRE-1/XBP-1的两条通路蛋白表达;2观察ERS抑制剂对脂质沉积的影响:TUDCA组TG减少了40%(P<0.01),油红O染色显示较F组脂滴明显减少,4-PBA组减少50%(P<0.01),油红O染色显示4-PBA组较F20组脂滴明显减少;3观察ERS抑制剂对脂质从头合成的影响:TUDCA组较F组SREBP-1c降低了20%(P<0.01),Ch REBP降低了15%(P<0.05),ACC、FAS、SCD-1表达下降,差异有统计学意义(均P<0.05),4-PBA组较F组SREBP-1c降低了40%(P<0.01),Ch REBP降低了42%(P<0.05),ACC降低了33%(P<0.05)、FAS、SCD-1下降了28%和25%,差异有统计学意义(均P<0.01);4观察ERS诱导剂对ERS的影响:Tg组的p-PERK、p-IRE-1/IRE-1、p-IRE-1/IRE-1、ATF-4和XBP-1s的蛋白水平较N组明显升高,有统计学意义(均P<0.01),Tm组较N组明显升高,有统计学意义(均P<0.01);5观察ERS诱导剂对脂质沉积的影响:Tg刺激后较N组TG升高了200%(P<0.01),Tm刺激后较N组TG升高为180%(P<0.05),油红O染色显示的Tg和Tm组培养的Hep G2细胞脂滴明显增多;6观察ERS诱导剂对脂质从头合成的影响:与N组比较,Tg组SREBP-1c、Ch REBP表达增加(均P<0.01),FAS表达增加(P<0.01),ACC和SCD-1表达增加(均P<0.05),与N组比较,Tm组SREBP-1c、Ch REBP表达增加(均P<0.01),FAS、ACC和SCD-1表达增加(均P<0.01)。结论:1高果糖培养Hep G2细胞可引起ERS;两种ERS抑制剂4-PBA和TUDCA均可以降低高果糖所致Hep G2细胞内TG水平的升高,减轻Hep G2细胞的脂质沉积,抑制高果糖诱导的SREBP-1c、Ch REBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的蛋白表达水平的增加,因此提示ERS与脂质从头合成密切相关;2应用两种ERS诱导剂Tunicmycin和Thapsigargin引起ERS,使肝细胞脂质沉积增多,显著增加肝脏脂质合成酶的上游转录因子SREBP-1c、Ch REBP的基因和ACC、SCD-1、FAS的蛋白表达水平,因此提示ERS可能参与脂质从头合成增多所致的肝细胞脂质沉积。第三部分IRE-1/XBP-1信号通路对Hep G2细胞脂质从头合成的影响目的:探讨敲低XBP-1或过表达XBP-1s对Hep G2细胞的TG,脂质沉积和SREBP-1c、Ch REBP、ACC、FAS、SCD-1的影响。方法:首先转染针对Hep G细胞XBP-1的shRNA,分为四组:正常对照组(简称N组)、高果糖组(简称F组)、高果糖+阴性对照组(简称F+NC组)、高果糖+XBP-1 sh RNA组(简称F+XBP-1 sh RNA组),再分别转染针对Hep G细胞XBP-1s和XBP-1u的过表达质粒,分为四组:未转染组(简称Untransfection组)、阴性对照组(简称pc DNA3.1(+)组)、XBP-1u上调组[简称pc DNA3.1(+)-XBP-1u组]、XBP-1s上调组[简称pc DNA3.1(+)-XBP-1s上调组],测定各组Hep G2细胞内TG水平和油红O染色观察细胞脂质沉积,检测各组与肝脏脂质从头合成的上游转录因子SREBP-1c和Ch REBP的基因水平,以及下游脂质合成的关键酶类ACC、FAS、SCD-1的蛋白水平。结果:1转染XBP-1 sh RNA对XBP-1s的影响:F+XBP-1 sh RNA组的XBP-1s的表达水平比F组都显著降低大于70%,差异有统计学意义(P<0.01),说明XBP-1s表达水平被有效抑制;2转染XBP-1 sh RNA对Hep G2细胞脂质沉积的影响:F+XBP-1 sh RNA组TG比F组降低了34%,有统计学意义(P<0.01),油红O染色示脂滴减少,F+NC组TG无变化(P>0.05),油红O染色示大量红染,与F组无明显差异;3转染XBP-1sh RNA对脂质从头合成的影响:F+XBP-1 sh RNA组与F组比较SREBP-1c的基因水平降低了40%(P<0.01),Ch REBP无明显变化(P>0.05),ACC的蛋白表达水平降低(P<0.01),FAS、SCD-1的蛋白表达水平降低(均P<0.05);4转染XBP-1s过表达质粒对IRE-1/XBP-1的影响:pc DNA3.1(+)-XBP1s组的活性XBP-1s表达水平比untransfection组、pc DNA3.1(+)组、pc DNA3.1(+)-XBP-1u组显著,差异有统计学意义(均P<0.01),XBP-1u和p-IRE-1/IRE-1水平比pc DNA3.1(+)-XBP-1u组明显降低(P<0.05),提示活性的XBP-1s被有效过表达,XBP-1s与XBP-1u、IRE-1符合负反馈调控;5转染XBP-1s过表达质粒对Hep G2细胞脂质沉积的影响:pc DNA3.1(+)-XBP1s组TG升高50%,差异有统计学意义,(P<0.01),油红O染色示脂滴增多;6转染XBP-1s过表达质粒对脂质从头合成的影响:pc DNA3.1(+)-XBP1s组SREBP-1c的基因水平的表达增加(P<0.01),ACC、SCD-1的蛋白表达增加(均P<0.01),FAS的蛋白表达增加(P<0.05),Ch REBP无明显变化。结论:1转染针对Hep G2细胞XBP-1的sh RNA后,高果糖所诱导的甘油三脂沉积可以被缓解,同时,SREBP-1c和ACC、FAS、SCD-1的表达水平有所下降,提示IRE-1/XBP-1通路与脂质从头合成有关;2上调Hep G2细胞XBP-1s后,可以引起甘油三脂沉积,SREBP-1c和ACC、FAS、SCD-1表达水平增加,提示SREBP-1c可能是IRE-1/XBP-1通路诱导肝细胞脂质从头合成的重要靶点,而Ch REBP可能并未参与该过程。第四部分PERK/e IF-2α/ATF-4信号通路对Hep G2细胞脂质从头合成的影响究目的:探讨敲低或过表达ATF-4对Hep G2细胞的TG,脂质沉积和SREBP-1c、Ch REBP和ACC、FAS、SCD-1的影响。方法:首先转染针对Hep G细胞ATF-4的siRNA,分为四组:正常对照组(简称N组)、高果糖组(简称F组)、高果糖+阴性对照组(简称F+NC组)、高果糖+ATF-4 si RNA组(简称F+ATF-4 si RNA组),之后转染针对Hep G细胞ATF-4 si RNA的过表达质粒,分为四组:未转染组(简称Untransfection组)、阴性对照组(简称NC组)、ATF-4上调组(简称ATF-4+组),测定各组Hep G2细胞内TG水平和油红O染色观察细胞脂质沉积,检测各组与肝脏脂质从头合成的上游转录因子SREBP-1c和Ch REBP的基因水平,下游脂质合成的关键酶类ACC、FAS、SCD-1以及CHOP。结果:1转染ATF-4 siRNA对ATF-4和CHOP的影响:F+ATF-4 si RNA组ATF-4的表达水平比F组显著降低大于70%,差异有统计学意义(P<0.01),说明ATF-4表达水平被有效抑制;转染ATF-4 si RNA对CHOP的影响:F+ATF-4 si RNA组CHOP的表达水平比F组显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);2转染ATF-4 si RNA对Hep G2细胞脂质沉积的影响:F+ATF-4 si RNA组TG比F组降低了25%,有统计学意义(P<0.01),油红O染色示脂滴减少,F+NC组TG无变化(P>0.05),油红O染色示大量红染,与F组无明显差异;3转染ATF-4 si RNA对脂质从头合成的影响:ATF-4 si RNA组与F组比较SREBP-1c的基因水平降低了28%(P<0.01),Ch REBP的基因水平降低了20%(P<0.05),ACC、FAS、SCD-1的蛋白表达水平降低(均P<0.01);4转染ATF-4过表达质粒对ATF-4和CHOP的影响:ATF-4+组ATF-4的表达水平比untransfection组、NC组,差异有统计学意义(均P<0.01),提示ATF-4被有效过表达;CHOP的蛋白表达水平增加(P<0.01);5转染ATF-4过表达质粒对Hep G2细胞脂质沉积的影响:ATF-4+组TG升高40%,有统计学差异(P<0.01),油红O染色示脂滴增多;6转染ATF-4过表达质粒对脂质从头合成的影响:ATF-4+组SREBP-1c和Ch REBP的基因水平的表达增加(均P<0.01),ACC、FAS、SCD-1的蛋白表达增加(均P<0.05)。结论:1转染针对HepG2细胞ATF-4的干扰si RNA后,高果糖所诱导的甘油三脂沉积可以被缓解,同时,SREBP-1c、Ch REBP和ACC、FAS、SCD-1的表达水平有所下降,提示PERK/e IF-2α/ATF-4通路与脂质从头合成有关;2上调Hep G2细胞ATF-4后,可以引起甘油三脂沉积,SREBP-1c、Ch REBP和ACC、FAS、SCD-1表达水平增加,SREBP-1c和Ch REBP可能共同参与PERK/e IF-2α/ATF-4通路诱导肝细胞脂质从头合成。