论文部分内容阅读
目的：研究微小RNA (microRNA, miRNA)在结肠癌细胞奥沙利铂(Oxaliplatin, OX A)耐药中发挥作用的分子机制,寻找与耐药相关的调控性分子,为制定有效的逆转肿瘤耐药方法奠定实验基础。方法：1.采用梯度诱导法建立OXA耐药的结肠癌细胞。2.利用miRNA芯片技术和实时荧光定量PCR (Real-time PCR)技术检测在耐药的结肠癌细胞中差异性表达明显的miRNA。3.选取在耐药细胞中低表达的miRNA-137作为研究对象,应用MTT方法验证miRNA-137对结肠癌细胞SW480和HCT-15耐药的影响。4.利用生物信息学方法筛选miRNA-137的候选靶基因YBX1,采用荧光报告载体实验验证miRNA-137对靶基因的直接调控作用。采用Real-time PCR和Western blot实验技术检测miRNA-137功能增强的结肠癌细胞中靶基因YBX1mRNA转录水平和蛋白水平表达,验证miRNA-137对靶基因的调控作用。用RNA干扰技术沉默该靶基因后,检测结肠癌细胞对OXA的敏感性。5.通过荧光定量PCR和免疫组化实验进一步验证临床结肠癌标本OXA耐药性与hsa-miR-137和YBX1的表达之间的关系。结果：1.利用浓度为0.2～2.0μM的OXA建立了OXA耐药的结肠癌细胞。2. hsa-miR-93、hsa-miR-191、hsa-miR-137、hsa-miR-491-3p、 hsa-miR-96、 hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-192在人结肠癌亲代细胞SW480和HCT-15与耐药细胞SW480/OXA和HCT-15/OXA之间存在明显差异性表达,在结肠癌细胞中进行MTT试验,结果显示：miR-93、miR-137、miR-21可调节OXA对结肠癌细胞的杀伤功能。3.荧光报告载体试验中miRNA-137能够通过作用于YBX1基因的3’非翻译区并对其表达进行负性调节。在miRNA-137表达减弱的结肠癌细胞中,YBX1基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平都有明显升高。4.在人结肠癌细胞SW480和HCT-15中,沉默YBX1后细胞对OXA和顺铂(CDDP)的耐药性明显减弱。5. Real-time PCR结果显示miR-137的转录水平与结肠癌组织的耐药性呈负相关趋势。Western blot (WB)和免疫组化显示YBX1在耐药的结肠癌组织中高表达,与结肠癌组织的耐药性呈正相关。结论：1.多种miRNA的异常表达与结肠癌细胞OXA耐药相关。2.在结肠癌细胞中miR-137负性调控靶基因YBX1的表达。3.miR-137通过靶定YBX1调节结肠癌细胞对化疗药物OXA敏感性。4.临床的结肠癌组织OXA耐药与miR-137及其靶基因YBX1表达相关。