论文部分内容阅读
利用曼地亚红豆杉(Taxus media)细胞大规模培养是生产紫杉醇的有效途径之一,添加诱导子能有效促进次生代谢产物合成。目前利用曼地亚红豆杉细胞培养生产紫杉醇仍未实现工业化,其主要原因之一是此法生产紫杉醇的成本较高,成为工业化生产的瓶颈。本研究以陕西关中地区10年生曼地亚红豆杉的茎、叶为材料诱导愈伤组织,筛选适宜外植体和培养基,并研究了 Vc等不同因子对褐化的影响,建立稳定的细胞悬浮培养系。同时研究了内生真菌诱导子对曼地亚红豆杉悬浮细胞产紫杉醇的影响,为紫杉生产醇提供了理论依据。本研究取得的主要结果如下:1、B5和MS培养基均可诱导出曼地亚红豆杉愈伤组织。其中,离体当年生新茎(Φ≈2 mm)和隔年茎(Φ≈2 mm)以B5为基本培养基诱导率较高;离体叶片以MS为基本培养基诱导率较高。两种培养基诱导外植体出愈时间差异不显著。不同外植体对愈伤组织诱导率差异显著,以B5为基本培养基,隔年茎(Φ≈2 mm)、当年生新茎(Φ≈2 mm)、当年生新茎(Φ≈1 mm)、隔年叶、当年生新叶愈伤组织诱导率分别为61.5%、86.7%、23.0%、15.0%及10.0%。消毒方式对不同外植体愈伤组织诱导中染菌率有明显影响。其中对于春夏季当年生新茎(Φ≈2 mm)以75%酒精消毒30 s,0.1%升汞14 min消毒效果较好;秋冬季新茎(Φ≈2 mm)为75%酒精消毒1 min,0.1%升汞消毒20 min效果较好。2、Vc、LH、PVP三种防褐化剂对红豆杉愈伤组织生长具有促进作用,其最适添加量依次为5 mg·L-1、1.0g·L-1、1.00mg·L-1。3、曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系接种量约为7.5 g·-1,整个悬浮培养过程,细胞的生长周期为30d,其中0～9d为调整期,9～18d为对数期,18～30d为稳定期,30d后为衰退期。在细胞培养的0～12 d,紫杉醇的产量基本为0,12 d以后,细胞逐渐开始生产紫杉醇,细胞培养的24 d,紫杉醇生产速率达到最大值,其积累量为17.04 mg·L-1。到细胞培养的30 d,紫杉醇积累量达到最大,为18.84 mg·L-1。显微观察到曼地亚红豆杉细胞多数呈圆形或椭圆形。4、以真菌培养液为诱导子,试验最佳处理条件为在细胞悬浮培养的14 d,加入发酵7d的真菌培养液,添加量为9%,此时悬浮细胞紫杉醇产量最高,达到45.32mg.L-1,是对照的的2.31倍。以真菌菌丝提取物为诱导子,结果表明在细胞悬浮培养的16 d,加入发酵6 d的真菌菌丝提取物,添加量为9%(v/v)时,悬浮细胞紫杉醇产量最高,为47.64 mg·L-1,是对照的2.74倍。