论文部分内容阅读
肌肉抑制素基因(Myostatin,MSTN)属TGF-β超家族,是肌肉细胞的自分泌因子,主要在动物骨骼肌中特异性表达并对肌肉的生长发育起到负调控作用,因此人工敲低MSTN基因表达可以有效促进成肌细胞分化为成熟肌纤维,使得肌肉组织量增加。本研究将干涉MSTN基因的shRNA序列与骨骼肌特异性启动子相连构建。RNA干涉载体并转染小鼠皮肤成纤维细胞,通过G418筛选含有neo抗性基因的转RNA干涉MSTN基因阳性细胞。为进一步通过体细胞核移植获得敲低MSTN蛋白基因的转基因鼠奠定基础。研究结果与结论如下:
1、小鼠肌肉生长抑制素基因的克隆:参照GenBank中序列(BC105674),采用RT-PCR扩增技术,克隆小鼠肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1(+)载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体；
2、RNAi表达载体的构建:参照肌肉抑制素基因的mRNA序列,设计符合“Tuschl”法则的siRNA,并将其以shRNA的序列方式连接到pRNAT-U6干涉载体,获得RNA干涉表达载体。将上述干涉载体和肌肉抑制素基因真核表达载体共同转染进293GP细胞中,利用Real-Time PCR仪检测干涉效率,获得干涉效率最高的siRNA序列；
3、骨骼肌特异RNA干涉载体的构建:本研究采用人工合成启动子SP作为特异性启动子替换RNAi载体中U6启动子,获得骼肌特异性启动的RNA干涉载体。
4、成纤维细胞的转染与筛选:采用阳离子脂质体法转染线性化的RNA干涉表达载体于小鼠皮肤成纤维细胞中,利用G418筛选获得neo基因的抗性细胞;
5、对neo基因抗性细胞的鉴定:对G418筛选获得的抗性细胞,采用PCR方法鉴定表明所构建的载体整合到细胞基因组中,并对获得的阳性细胞进行了细胞生物特性检测。与此同时,将转基因细胞冷冻后复苏,再次测定细胞生长曲线。以上结果均显示细胞曲线符合一般规律,转基因及冷冻未对细胞造成严重影响。
综上所述,采用上述方法,获得转RNA干涉MSTN基因小鼠成纤维细胞株。