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黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是研究季节性繁殖的典型动物,繁殖活动多集中在春末、秋初,冬季繁殖休止。动物的繁殖活动主要受下丘脑-腺垂体-性腺轴系统的调控。雌激素在繁殖活动中发挥重要的调控作用,其生物功能主要是通过与雌激素受体结合来实现的。雌激素膜性受体GPER1也叫GPR30,是较晚发现的一类由375个氨基酸残基组成的7次跨膜的G蛋白偶联受体。它与传统雌激素受体没有同源性,主要介导快速非基因效应,以第二信使cAMP和EGFR转活后的蛋白激酶途径。雌激素膜受体在动物繁殖调控中的作用尚少见报道。本研究以野生黑线仓鼠为动物模型,探究了GPER1在繁殖调控中的可能作用。首先采用RT-PCR方法克隆了雌激素膜受体基因GPER1 cDNA序列,分析其核苷酸序列、编码的氨基酸组成及理化性质,预测蛋白质三级结构,基于GPER1氨基酸序列构建系统进化树并进行同源性分析,为后续实验奠定了分子基础。随后,采用实时荧光定量PCR法和免疫组织化学法分别从基因和蛋白质两个层面探究了GPER1在不同年龄黑线仓鼠大脑中的差异表达。最后,通过不同的光周期处理,再次采用实时荧光定量PCR法和免疫组织化学法分别从基因和蛋白质两个层面探究了GPER1在黑线仓鼠大脑和哈氏腺中的差异表达。酶联免疫法同步测定了血清中促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌激素(E)浓度的影响,并对不同光周期模式下的黑线仓鼠进行体重检测与脏器系数监测,旨在进一步探究黑线仓鼠季节性繁殖调控的分子机制。研究首先克隆到黑线仓鼠GPER1 cDNA序列1806bp(Genbank登录号为MF993526),包括全部CDS编码区1107bp和部分5’和3’非编码区,共编码368个氨基酸。生物信息学分析发现GPER1是一种七次跨膜蛋白,属于G蛋白偶联受体家族,且其结构在进化过程中相对保守,也验证了克隆序列的正确性。对不同年龄黑线仓鼠大脑雌激素膜受体的表达模式研究结果显示:(1)雌性个体中,成年GPER1 mRNA水平显著低于亚成年和老年(P<0.05),幼年、亚成年和老年之间无明显差异;亚成年GPER1蛋白水平显著低于幼年、成年与老年。(2)雄性个体中,亚成年GPER1mRNA水平显著低于幼年与老年(P<0.05),幼年与成年、老年无明显差异,亚成年与成年之间也无显著差异;老年GPER1蛋白水平显著低于亚成年,幼年、亚成年、成年无显著差异。(3)在mRNA水平上,黑线仓鼠大脑内GPER1的相对表达量在幼年、老年、成年组中存在显著的性别差异(P<0.05),在成年组中有极显著的性别差异(P<0.01)。(4)在蛋白质水平上,黑线仓鼠大脑内GPER1蛋白表达量在幼年、老年中存在极显著的性别差异(P<0.01),成年中有显著的性别差异(P<0.05),而在亚成年中则无显著的性别差异(P>0.05)。(5)血清中FSH、LH、E浓度基本呈现随年龄增长而降低的趋势。以上结果提示,雌激素膜受体在不同性别和不同年龄黑线仓鼠大脑均可表达,表达量存在性别差异和年龄差异,说明GPER1参与了黑线仓鼠繁殖发育调控的过程。mRNA和蛋白质表达呈现出不同的规律则提示雌激素膜受体表达可能受到翻译后水平的调控。光周期处理对黑线仓鼠大脑和哈氏腺中雌激素膜受体的表达模式研究结果显示:(1)大脑内,雌雄个体在长日照(LD)下GPER1 mRNA表达上调,短日照(SD)下表达下调;性别差异分析显示,在mRNA水平上,黑线仓鼠大脑内GPER1的相对表达量在LD条件下,表现出了极显著的性别差异(P<0.01),而在SD条件下则无显著的性别差异(P>0.05);在蛋白质水平上,大脑中GPER1蛋白表达量在LD条件下显著低于SD条件下(P<0.05)。并且在蛋白质水平上,黑线仓鼠大脑内GPER1蛋白表达量在LD条件下无显著性的性别差异(P>0.05),SD条件下雌性表达量显著高于雄性(P<0.05);(2)哈氏腺中,雌雄黑线仓鼠GPER1 mRNA表达在长日照下高于短日照;性别差异分析显示,mRNA水平上无显著的性别差异(P>0.05);在蛋白水平上,雌性LD条件下GPER1蛋白表达显著高于SD条件下的表达(P<0.05),雄性中无显著性的差异(P>0.05);性别差异分析显示,SD条件下雄性蛋白表达显著高于雌性(P<0.01),LD下表达无显著性的性别差异(P>0.05)(3)长日照下体重、子宫系数、卵巢系数、睾丸系数、附睾系数等高于短日照。(4)黑线仓鼠血清中FSH、LH、E这些激素的浓度在长日照条件下显著高于短日照。以上结果提示:光周期是影响黑线仓鼠季节性繁殖的重要因素,光周期处理可以改变黑线仓鼠的体重和繁殖器官的脏器系数,长日照能够促进体重和性腺的增长,而短日照能够导致体重减少和性腺的萎缩。不同光周期处理时,黑线仓鼠大脑和哈氏腺中均有雌激素膜受体的表达。哈氏腺作为光感受器参与了季节性繁殖调控,光周期可以通过影响GPER1在大脑中的表达来调控繁殖活动。综上所述,动物的繁殖调控有众多的内外因素的参与,作为一个较新研究的内源性因子,本研究初步揭示了GPER1在黑线仓鼠繁殖调控中的作用,其中更详细的机制还需要进一步的研究,GPER1未知的功能有待被发现。