本文围绕前列腺癌的基础和临床展开,尝试阐明TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌发病中的作用机制；同时,针对当前前列腺癌早期诊断中存在的问题,试图发现可用于前列腺癌诊断的新的生物标志物。1.染色体结构的改变常见于恶性肿瘤细胞中,其中染色体易位导致原癌基因的融合可能是某些肿瘤发生的重要原因。2005年,Tomlins等在Science(?)报道在前列腺癌中发现了受雄激素调控的基因TMPRSS2和原癌基因ETS家族成员发生了融合,随后的几个独立研究结果显示该类融合基因在高加索前列腺癌病人群体中的出现比率约为50%-70%,其中最常见的融合类型为TMPRSS2-ERG,约占50%。近年来对TMPRSS2-ERG融合基因功能的研究已初步表明该融合基因对细胞的增殖、分化、侵袭等性状均具有一定的影响。由于肿瘤的发生和发展一方面体现在不受控的细胞增殖,另外同样重要的一个因素则是肿瘤细胞的凋亡异常。因此,TMPRSS2-ERG基因是否影响细胞的凋亡是一个值得深入研究的问题。此外,由于前列腺癌在不同遗传背景的人种群体间发病率和致死率差异均较大,而对这一融合基因的研究以往都以欧美人群为主,亚洲人群,尤其是中国人群这一融合基因的发生率如何还不清楚。因此,本论文第一部分的研究内容分为两个方面,首先筛查融合基因在中国前列腺癌病人群体中的出现频率,其次对TMPRSS2-ERG融合基因是否影响细胞凋亡进行探讨。我们推测：融合基因TMPRSS2-ERG在中国前列腺癌病人群体中发生的频率可能不同于基于高加索病人群体的检测结果。由于融合基因TMPRSS2-ERG的编码蛋白和同一家族Fli-1基因编码蛋白具有相同的结构域,因此可能和Fli-1类似,参与细胞凋亡的调控。2.由于目前对晚期前列腺癌的治疗很难达到理想的效果,所以当前更重要的一个问题是该疾病的早期诊断。尽管前列腺特异性抗原(prostate specifinc antigen, PSA)的检测是一种常规的检测手段,但其灵敏性和特异性都欠佳,急需发现一种更好的检测指标。近几年来,已有许多研究证明在血清或血浆中有稳定的循环microRNAs(miRNAs)存在,进一步的研究表明miRNAs具有作为癌症标志物的潜能,并且外周血miRNAs的表达谱可以区分各类肿瘤,具有组织特异性。新的证据显示糖尿病患者血清miRNA表达谱与健康对照比较也有显著的差异；同时,miRNAs也可用来区分诊断急性肝脏损伤等疾病,并可用作心肌损伤的标志物。这些研究都表明外周血循环miRNA具备良好疾病标志物的潜能,因此本论文的第二部分中我们检测并尝试筛选出前列腺癌特异性的循环miRNAs,以验证这些miRNAs潜在的诊断效能。第一部分前列腺癌融合基因TMPRSS2-ERG的研究目的：初步评估TMPRSS2-ETS融合基因在中国前列腺癌病人群体中的出现频率,获得TMPRSS2-ERG融合基因参与细胞凋亡调控的证据。方法：1.前列腺癌穿刺标本抽提总RNA,nest-PCR检测融合序列,经T/A克隆入载体,测序验证。2.构建融合基因编码序列ΔERG稳转细胞株,划痕实验检测稳转细胞株的迁移率；CCK-8测定生长曲线及细胞毒性；Western Blot检测凋亡相关蛋白；Annexin-V PE和7-AAD双染色后,流式细胞仪检测凋亡；siERG转染稳转细胞株介导ΔERG基因的表达下调；荧光实时定量PCR检测凋亡相关基因的表达。结果：1.在我们获得的27列前列腺癌样本中检出6例TMPRSS2-ERG基因融合,占22%,未检测到TMPRSS2-ETV1基因融合。5份良性增生(BPH)样本中未检测到融合基因。但在一例前列腺癌样本中发现一种新的融合基因TMPRSS2-EGR1,其功能有待进一步的研究。2.成功构建高表达ΔERG的稳转细胞株,细胞生长曲线和迁移率和空载体对照细胞株无明显差异。顺铂(cisplatin)处理48h后,ΔERG稳转株存活率为对照细胞株的3倍,流式细胞仪检测到的细胞凋亡率各为25.89±9.66%和67.26±9.07%。在△ERG基因干扰后的试验中其凋亡比率由原来的41.50±6.70%升至59.64·3.23%。3.Western Blot结果显示AERG稳转株细胞处理后caspase-3和Parp-1的断裂片段的蛋白量显著低于对照细胞。定量PCR表明与凋亡直接相关的基因BCL-2, BCL-XL,BAX,BIM与对照组空载体细胞株相比都没有明显的表达变化；间接与凋亡通路相关的基因ATF-5(activating transcription factor 5)则上升了2.5倍左右。两种细胞DNA损伤指标γH2AX的蛋白表达量则相差1.5倍左右。结论：1.我们的初步筛选结果表明TMPRSS2-ERG融合基因在中国前列腺癌病人群体中出现频率较低,有必要扩大样本量进一步验证。2.在前列腺癌中发现一例新的融合基因TMPRSS2-EGR1。3.TMPRSS2-ERG融合基因T3/E5可编码N端缺失的ERG蛋白(△ERG),△ERG可抑制顺铂诱导的DNA损伤,并进而抑制顺铂诱导的细胞凋亡第二部分循环MicroRNA作为前列腺癌诊断指标的研究目的：通过对循环miRNAs的筛查发现前列腺癌特异性的miRNAs,并验证其诊断效能。方法：1.本实验包括筛选鉴定和独立验证两个步骤,筛选组由17份正常对照和25份前列腺癌(CaP)病人的血样组成,另一组为独立验证组,包括44份正常对照样本和80份前列腺癌样本。2.采用Illumina’s miRNA表达分析平台,筛选前列腺癌患者和正常对照组之间的循环miRNAs的表达谱差异,并用实时荧光定量PCR于独立的大样本中进一步鉴定和验证差异表达miRNAs,根据ROC曲线分析其诊断效能,并用主成分分析法评估鉴定的6个miRNAs的联合诊断价值。结果：1.筛选阶段在两种样本中发现有8个miRNAs(let-7c, let-7e, miR-25, miR30c, miR-346, miR-622, mir-940, and miR-1285)表达水平具有显著差异,最后验证阶段验证获得6个miRNAs (let-7c, let-7e, miR30c, miR-622, mir-940, and miR-1285)。2. ROC(Receiver operating characteristic)曲线分析显示6个miRNAs都具有一定的诊断价值,曲线下面积(AUC)分别为0.784,0.805,0.759,0.755,0.731和0.669。3.主成分分析(PCA)表明6个miRNAs表达数据的第二主成分可以更为高效地鉴别出前列腺癌,其ROC曲线下面积为0.925。结论：前列腺癌特异的循环miRNAs具有诊断潜能,较之单个miRNAs,联合应用鉴定的6个miRNAs作为诊断模板可以显著提高诊断效能,更为精确地鉴别前列腺癌。