论文部分内容阅读
研究背景高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound,HIFU）是一种非侵入性治疗技术,其原理是利用超声的机械效应、热效应和空化效应使得靶区组织产生瞬时高温,造成不可逆的凝固性坏死,在临床上已广泛用于子宫肌瘤、肝癌、前列腺癌等实体肿瘤的治疗。相比与微波消融等传统无创治疗方法有着安全性高、操作简便及副作用低等优点。但是随着距离的增加,超声能量会发生衰减,增加治疗功率和时长会引起副作用。有学者通过引入液态氟碳类物质作为HIFU增效剂来提高HIFU消融效率,但其靶向性不强。课题组前期研究利用双歧杆菌体外结合HIFU增效物质构建成生物靶向增效剂,能够靶向增强HIFU消融的效果,但仍存在体内连接不稳定的问题。工程大肠杆菌BL21菌株（Escherichia coli BL21（AI）,E.coli BL21（AI））属于非致病性菌株,经声学信使基因（Acoustic reporter genes,ARGs）重组后表达气体囊泡（Gas vesicles,GVs）能用于超声显像,而气体是增效HIFU的主要物质,所以气体囊泡理论上能用于超声治疗的增效。因此,本研究探索利用自身表达气体囊泡的大肠杆菌BL21（AI）作为新型HIFU生物靶向增效剂,验证其增强HIFU消融的效果,并在增效剂量下探讨其相关安全性。目的:探讨E.coli BL21（AI）体内表达的GVs对HIFU消融肿瘤的增效作用以及相关安全性。方法:1.制备E.coli BL21（AI）-GVs,诱导ARGs基因重组E.coli BL21（AI）表达GVs,透射电镜观察基本形态,检测其生长情况及体外靶向乏氧区能力。选取12只荷瘤小鼠,于注射后1、4和14天,通过组织匀浆观察肿瘤靶向性。2.E.coli BL21（AI）-GVs增效HIFU消融实验:选取20只荷瘤小鼠,随机分为高剂量组（1×10~9CFU/m L）、中剂量组（1×10~8CFU/m L）、低剂量组（1×10~7CFU/m L）和PBS对照组,对肿瘤区域进行HIFU点辐照并观察超声灰度值变化,于辐照后24h行TTC染色,计算凝固性坏死体积和能效因子,肿瘤组织HE染色及TUNEL免疫组化分析不同剂量的E.coli BL21（AI）-GVs增强HIFU消融肿瘤的效果。3.E.coli BL21（AI）-GVs的相关安全性实验:选取48只正常BALB/c小鼠,随机分为高剂量组（1×10~9CFU/m L）、中剂量组（1×10~8CFU/m L）、低剂量组（1×10~7CFU/m L）与PBS对照组,于注射后第1d、4d、14d和30d,进行血培养检测。选取192只正常BALB/c小鼠,随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组与PBS对照组,于注射后1d,4d,14d和30d分别检测各剂量组血常规、肝功,肾功和心肌酶谱血生化指标,ELISA试剂盒检测血清细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-4的水平。30d后检测主要脏器的脏器指数并进行组织病理HE染色检查,评价其安全性。结果:1.透射电镜下E.coli BL21（AI）-GVs呈中空、两端呈双锥状的圆柱体形,直径45-250nm,长度100-400nm。定量测得1OD600=1.07×10~9CFU菌落数。注射后4d,细菌在肿瘤体内的定植量达到峰值。2.在体HIFU消融实验显示,灰度变化值及凝固性坏死体积为:高剂量组>中剂量组>低剂量组>PBS对照组（P<0.05）;能效因子为:高剂量组<中剂量组<低剂量组<PBS对照组（P<0.05）。肿瘤组织HE,TUNEL免疫组化结果显示高、中和低剂量组的肿瘤细胞均出现凋亡情况,高剂量组细胞凋亡最为明显。3.相关安全性实验显示,血培养提示静脉注射后14d内血液中未检测出细菌生长。注射后1d高剂量组WBC、PLT和LYMPH低于PBS对照组（P<0.05）,NEUT高于PBS对照组（P<0.05）,第4、14和30d高剂量组WBC、PLT、LYMPH和NEUT与PBS对照组相比无明显差异（P>0.05）;中、低剂量组血常规指标与PBS对照组相比均无明显差异（P>0.05）。高、中及低剂量组肝功、肾功、心肌酶谱指标和脏器指数与PBS对照组相比无明显差异（P>0.05）。注射后1d和4d高剂量组细胞因子TNF-α和IL-4均高于PBS对照组（P<0.05）,第14d和30d高剂量组TNF-α和IL-4含量与PBS对照组相比无明显差异（P>0.05）,而中、低剂量组TNF-α和IL-4与PBS对照组相比无明显异常变化（P>0.05）。高、中及低剂量组IL-1β水平与PBS对照组相比无明显差异（P>0.05）。主要脏器组织的病理结果显示,高、中及低剂量组未发现明显异常改变。结论:1.本课题成功构建生物靶向增效剂E.coli BL21（AI）-GVs,具有良好肿瘤靶向性,在1×10~7CFU～1×10~9CFU的剂量范围具有增效HIFU消融肿瘤的能力。2.E.coli BL21（AI）-GVs在1×10~9CFU下出现一过性炎性反应症状,在1×10~7CFU～1×10~8CFU增效剂量下具有良好安全性,可安全有效增效HIFU消融肿瘤。