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利用猪繁飧与呼吸综合征病毒四川分离株(PRRSV-SC1)感染体外培养的Marc-145细胞为模型,开展了以下两方面的研究:①利用透射电镜和超薄切片技术研究了PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间病毒的形态发生学和细胞超微结构的变化:②利用光学显微镜观察、透射电镜观察、DNA Ladder、ELISA、TUNEL五种方法研究了PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间所引起的细胞凋亡及其动态变化规律。 1、病毒的形态发生学 透射电镜观察结果显示,病毒粒子呈球形,有囊膜,大小约45—65nm,内含直径大小约25—30nm的核衣壳。病毒感染细胞后吸附于细胞膜表面,然后以细胞内吞方式进入细胞,内在化后释放核酸,在胞浆内复制,有的以出芽方式进入胞浆空泡获得囊膜,在空泡内聚集,然后空泡向细胞膜靠近,空泡膜与细胞膜融合,最后以细胞外分泌方式释放到细胞外;有的散在于细胞质中,游离向细胞膜,以出芽方式释放到细胞外并获得囊膜。 2、细胞超微结构变化 病毒感染细胞后细胞超微结构变化主要表现为:感染前期,细胞无明显超微结构变化。随着时间进程的发展,细胞超微结构发生一些变化:滑面内质网空泡化,粗面内质网轻微扩张:线粒体肿胀、嵴断裂、溶解,最后空泡化;核膜轻微扩张,细胞核染色质浓缩、呈新月状或环状附着于核膜内侧;有的核膜逐渐消失,核裂解,细胞膜内陷并将细胞内容物包裹,然后出芽,形成凋亡小体:然后整个细胞内的细胞器空泡化,其中包含有一种电子密度与核仁相似大小不一的颗粒,溶酶体和脂褐素,最后细胞裂解,破碎。 3、PRRSV感染Marc-145细胞后引起的细胞凋亡 (1) HE染色后,光镜下观察细胞凋亡情况,结果显示凋亡细胞变圆、变小,细胞核固缩,染色质被染成深蓝色或蓝黑包,胞浆呈淡红包。(2) 透射电镜观察,凋亡细胞胞浆浓缩,细胞核染色质凝聚,或呈新月状或环状附着于核膜内侧,或占据整个细胞核,有的核膜消失,核裂解,细胞膜内陷,将细胞内容物包裹,然后出芽,形成凋亡小体。(3) DNA Ladder、ELISA和TUNEL检测结果显示,PRRSV感染细胞后,随时间不同,其引起细胞凋亡的程度不同,与正常组细胞相比,在感染后的前24h,感染组调亡细胞与对照组相比差异不显著(P>0.05),在感染后48h、72h、96h、120h感染组凋亡细胞与对照组相比差异极显著(P<0.01)。在感染后72h细胞凋亡达到高峰,随后细胞凋亡水平又有所下降。在感染后144h,DNA Ladder无法检测到凋亡,ELISA法检测到低于正常组细胞的凋亡水平,TLNEL法检测到极少量的凋亡细胞。三种生化指标检测方法所检测到细胞凋亡及其动态变化规律基本一致。