目的本实验研究是以转录组测序技术(RNA-Seq)为基础,分析氟康唑与钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A联合应用对生物膜态白念珠菌转录谱的影响,寻找并验证与白念珠菌生物膜形成以及耐药等相关的功能基因。方法构建白念珠菌标准菌株SC5314的生物膜模型,XTT法测定氟康唑、环孢菌素A对生物膜态白念珠菌细胞活性的影响,并将其分为生物膜态无处理组与氟康唑、环孢菌素A联合用药两个处理组。提取两处理组的RNA,利用高通量RNA-Seq技术,分析联合用药与无处理组之间转录组的差异。对获得的差异表达基因,分析其与生物膜形成、耐药等的相互关系,并选取代谢通路进行干预,利用实时荧光定量q RT-PCR技术对筛选出来的与标准菌株产生物膜能力和药敏结果相同的白念珠菌临床株进行目的基因的验证。结果通过产膜能力实验,筛选出8株与标准菌株产膜能力相同的临床菌株,且临床菌株对氟康唑的药敏结果与标准菌株一致,均为敏感。观察生物膜形成过程发现当培养至48h时,生物膜已成熟。棋盘法药敏实验结果显示,当单用环孢菌素A及单用氟康唑时,与无处理相比,抑制生物膜的效果极低。然而当用浓度为75μg/ml的环孢菌素A与32μg/ml的氟康唑联合使用时,显示出较强的抗生物膜作用,差异有统计学意义。针对测序结果,共发掘231个新基因及522个差异表达基因,包括253个上调基因和269个下调基因。通过分析,初步筛选出9个目的基因,GO功能分类结果显示,这些基因主要涉及细胞壁、浆膜的合成,外排转运,免疫反应,菌相转换等功能。KEGG分析表明这些差异表达基因参与糖酵解,脂肪酸代谢,细胞因子受体相互作用,细胞分裂等信号通路。利用临床白念珠菌对目的基因验证发现,这些目的基因变化与转录组结果一致。其中,als3,cdr1,cln1,cln2,rfg1,erg3,ddc1表达量呈不同程度的升高或降低,与无处理相比,差异具有统计学意义(而cpp1,efg1呈现出升高和降低的趋势,差异无统计学意义)。针对差异基因所注释到的通路糖代谢途径进行干预,发现乙醛酸循环途径与白念珠菌感染息息相关。针对乙醛酸循环途径进行干预,结果表明当抑制乙醛脱氢酶时,生物膜形成相关基因表达量升高;当乙醇含量增加时,与生物膜形成相关的基因表达量反而减低。因此在后续的实验中,我们可以以此作为新的切入点,深入探索白念珠菌生物膜与耐药性的相关机制。结论1.通过观察白念珠菌生物膜的形成过程发现,起初以酵母态白念珠菌为主,但随着时间不断延长,酵母态逐渐转变为菌丝态。至48h时菌丝交织非常密集,细胞外基质分泌较多,之后生物膜增长较少,此时生物膜已成熟。2.通过药敏实验发现,生物膜态白念珠菌对氟康唑的敏感性显著降低。当在联合环孢菌素A后,其可以降低生物膜对氟康唑的耐药性,增强抗菌效果。3.通过转录组测序技术,共发现了231个新基因以及522个差异表达基因。通过对差异表达基因进行初步分析、功能注释及利用临床株验证,初步寻找出9个相关的目的基因。在验证目的基因的过程中,一方面证实了它们的功能,同时也用功能比较明确的基因(als3,cdr1)验证了转录组测序技术的可靠性。4.通过对测序结果代谢通路的差异分析,发现糖代谢通路的参考价值最可靠,进而针对乙醛酸循环加以研究,发现乙醇在抗白念珠菌上有着巨大的潜力,双硫仑与理论结果估计不一致,通过分析我们推测此现象可能与双硫仑的浓度大小以及其处理白念珠菌时生物膜所处的阶段有关,具体原因需后续做深一步的探索。