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肺癌的发病率和死亡率目前已经排在各种恶性肿瘤的第一位,但其发病机制尚未阐明,且缺乏早期诊断指标。核不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)是一种重要的RNA结合蛋白,主要负责基因转录后调控。目前已知DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase,MGMT).8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-oxoguanine DNA glycosylase,OGGl).氧化/还原因子-1(redox factor 1, ref-1).2种DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)—DNA-PKcs和ku在肺癌组织中的表达与正常肺组织有明显差别,均与肺癌的发生相关。基于以上背景,本研究目的旨在观察hnRNP A2/B1蛋白及mRNA在非小细胞肺癌(non-smal l ce l l l ung cancer,NSCLC)癌组织及对应正常肺组织中的表达情况；检测hnRNP A2/B1蛋白与DNA修复酶MGMT、OGG1、ref-1、DNA-PKcs和Ku的mRNA是否结合,初步探讨其对5种DNA修复酶是否存在转录后调控作用,试图揭示其在NSCLC发病机制中的作用；并探讨痰中检测hnRNP A2/B1在肺癌早期诊断中的意义以及胸水检测hnRNP A2/B1对于鉴别肺腺癌细胞与间皮细胞的价值。方法分别从蛋白水平及mRNA水平检测hnRNP A2/B1在NSCLC中的表达情况：采用免疫组织化学方法检测50例、Western Blot方法检测10例及荧光实时定量PCR(real-t ime PCR)方法检测22例NSCLC患者癌组织及对应正常肺组织中hnRNPA2/B1的表达情况；采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,co-IP)结合逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法研究人肺鳞癌细胞株(HTB-182)中hnRNPA2/B1蛋白是否与5种DNA修复酶的mRNA目结合,之后采用免疫组织化学方法检测50例(标本同检测hnRNP A2/B1所用标本)及real-time PCR方法检测22例NSCLC(标本同检测hnRNP A2/B1所用标本)患者癌组织及对应正常肺组织中MGMT的表达情况。另收集63例疑诊肺癌患者的痰标本,分别采用痰涂片及细胞块切片细胞学检查(镜检找到癌细胞即诊断为肺癌)和痰细胞块切片免疫组织化学检测hnRNP A2/B1(表达阳性即诊断为肺癌)的方法进行诊断,比较两种诊断方法的结果。采用细胞块技术结合免疫组织化学方法检测100例胸水标本中hnRNP A2/B1的表达情况,观察其表达在肺腺癌细胞和间皮细胞中的差异。所有数据采用SPSS 13.0统计软件包进行处理,以p<0.05视为有统计学意义。结果HnRNP A2/B1蛋白及mRNA在NSCLC癌组织中的表达较对应正常肺组织升高：免疫组织化学显示hnRNP A2/B1定位于细胞核,其在NSCLC癌组织中的阳性率及评分(100%,5.3±0.9)均显著高于正常肺组织(32%,2.2±0.7)(p<0.01),在Ⅲ-Ⅳ期NSCLC癌组织中的表达略高于Ⅰ-Ⅱ期,在NSCLC癌组织中的表达与年龄、性别、肿瘤类型及吸烟史无明显相关性(p>0.05)；Western Blot检测结果显示hnRNP A2/B1在NSCLC癌组织中的平均灰度比值(1.4±0.5)明显高于正常肺组织(0.7±0.2)(p<0.01);real-time PCR检测结果显示hnRNP A2/B1 mRNA在NSCLC癌组织中的平均表达量37.4(15.6～82.6)明显高于正常肺组织17.6(7.8～27.8)(p<0.01)。免疫共沉淀实验先将人肺鳞癌细胞株(HTB-182)中的hnRNP A2/B1蛋白与hnRNP A2/B1单抗的抗原抗体复合物沉淀,之后RT-PCR检测从免疫共沉淀产物中扩增出MGMT mRNA,提示hnRNP A2/B1蛋白与MGMT mRNA相结合,之后的免疫组织化学和real-time PCR检测揭示MGMT蛋白及mRNA在NSCLC癌组织中的表达均较对应正常肺组织减低：免疫组织化学显示MGMT定位于细胞核,其在NSCLC癌组织中的阳性率及评分(32%,2.2±0.8)均明显低于正常肺组织(78%,4.1±1.2)(p<0.01)；对hnRNP A2/B1与MGMT在NSCLC癌组织中的表达评分作相关性分析,得出两者存在负相关关系(F=-0.49,p<0.01)；real-time PCR检测结果显示MGMT在NSCLC癌组织中的平均表达量1.8(0.6～3.1)明显低于正常肺组织9.8(6.8～18.3)(p<0.01)。痰涂片及细胞块切片细胞学检查诊断肺癌的敏感度为31.8%,特异度为100%。痰细胞块检测hnRNP A2/B1诊断肺癌的敏感度为80%,特异度为68.4%。痰检hnRNP A2/B1的敏感度明显高于痰细胞学检查(p<0.01)。HnRNP A2/B1在胸水肺腺癌细胞中的表达阳性率为100%(60/60),在间皮细胞中阳性率为30%(12/40),两组间存在显著差异(p<0.01)。HnRNP A2/B1标记胸水肺腺癌细胞的敏感度为100%,特异度为70%。结论1.本研究通过免疫组织化学检测、Western Blot检测及荧光实时定量PCR检测揭示hnRNP A2/B1蛋白及mRNA在NSCLC癌组织中的表达均较对应正常肺组织升高,且免疫组织化学结果显示病变越晚期hnRNP A2/B1表达越高,提示它可能与NSCLC的发生发展有关,而hnRNP A2/B1在NSCLC癌组织中的表达与年龄、性别、组织学类型及吸烟史无明显相关性。2.本研究通过免疫共沉淀结合RT-PCR技术发现hnRNP A2/B1蛋白与MGMT mRNA相结合,提示hnRNP A2/B1可能对MGMT mRNA存在转录后调控作用。之后的免疫组织化学检测及荧光实时定量PCR检测表明MGMT蛋白及mRNA在NSCLC癌组织中的表达均较正常肺组织减低,推测hnRNP A2/B1可能通过对MGMT mRNA转录后调控,下调MGMT蛋白表达,削弱细胞DNA损伤修复能力,从而参与非小细胞肺癌的发生。3.痰细胞块结合免疫组织化学法检测hnRNP A2/B1诊断肺癌的敏感度明显高于痰细胞学检测,更有利于发现早期肺癌。胸水细胞块结合免疫组织化学法检测hnRNP A2/B1对于鉴别肺腺癌细胞和间皮细胞很有帮助。