Red/ET重组工程已成为分子生物学中常用的技术和研究大肠杆菌基因组常用的手段。它由于有着重组效率高、同源序列短、操作过程简便的同时不会引入其他碱基的优点而得到广泛应用。研究中将归巢内切酶I-SceI应用与Red重组系统中实现了基因组染色体的无痕敲除。异源蛋白由于其所使用的密码子与大肠杆菌不同,不能以可溶性蛋白表现出来,为研究基因和蛋白的功能带来许多困难。可通过目的基因和融合标签进行融合表达以增加目的异源蛋白表达的可溶性来解决这一难题。融合标签指与目的蛋白融合表达时可促进目的蛋白表达量并增加其可溶性的一类蛋白,麦芽糖结合蛋白(MBP)是最常用的融合标签。TEV蛋白酶(TEVProtease)是来源于烟草蚀纹病毒的Nla(Nuclear inclusion aprotein)蛋白酶,TEV蛋白酶因具有非常高的特异性和剪切活性,目前已成为去除融合蛋白表达后的融合标签的首选蛋白酶。TEV蛋白酶作用于在融合标签和目的蛋白之间加入的TEV酶切位点,便可将融合标签和目的蛋白分开,操作过程方便,因而得到广泛利用。但是目前TEV蛋白酶的市场售价较高,为实验研究带来了很多不便。本研究主要构建了一种基于基因组的TEV蛋白酶细胞内剪切体系LS2401。研究中采用的菌株为大肠杆菌BL21(DE3),该体系是将T7强启动子、麦芽糖结合蛋白基因malE、TEV蛋白酶表达基因、氯霉素抗性基因和TEV蛋白酶的酶切位点通过构建克隆的方法连接起来,采用同源重组的方法将以上基因元件取代BL21(DE3)基因组中的malE基因而得到。诱导蛋白表达后的TEV蛋白酶作用于该酶酶切位点,从而将MBP和TEV切开,实现细胞内剪切。其剪切效率可达80%以上,得到的TEV蛋白酶可通过简单的亲和层析分离纯化,且活性和产量均较高,为实验室的研究带来了很多方便。该体系应用于融合标签和目的蛋白的切割时,由于TEV蛋白酶在作用于目的蛋白的同时还将作用于基因组蛋白,会影响对目的蛋白的切割效率。接下来的实验是在此体系的基础上进行修改,研究中采用同源重组的方法并利用I-SceI介导的双链断裂修复将MBP-TEV中间的TEV酶切位点去除,实验中分别设计了 50 bp、500 bp同源臂,但此方法获得的结果并不理想。然后依旧用构建克隆的方法将MBP、TEV和组氨酸标签连接起来,取代BL21(DE3)基因组中的malE基因,构建了两个TEV蛋白酶的表达菌株,并将两个表达融合蛋白的质粒分别转化入两个体系中验证该体系的切割效率。从SDS-PAGE图中可看出,绝大多数的融合蛋白被切开,剪切效率为70%以上,带有标签的目的蛋白可采用相应的方法进行分离纯化。该自剪切体系可作为一个工具菌株应用于实验中,对目的蛋白进行切割,方便快捷,同时可将传统的目的蛋白的两次纯化较少为一次,减少科研的成本还能节约时间。