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目的目前已有若干国际知名公司的化学发光检测系列产品及配套仪器进入我国,但只有一部分大型医院使用。以罗氏公司Elecsys2010型电化学发光分析仪为例,仪器体积过大,检测时间长,试剂浪费严重,成本升高,而且罗氏电化学发光分析仪操作复杂,维修成本高,因此研制体积小,集成度高,可重复使用,检测成本低的分析仪器已显的十分重要。本项目将免疫磁珠技术与化学发光技术相结合,研制适用于微流控芯片分析系统的双抗夹心法和免疫竞争法的试剂,为研制体积小,可重复使用,检测成本低的免疫分析系统创造条件。方法一、聚苯乙烯磁性微球固化抗体采用碳二亚胺交联法,将TSH抗体和羊抗兔IgG抗体固化在聚苯乙烯磁性微球上,制备免疫磁珠,建立稳定、高效的免疫磁性微球的固化方法。将微流控芯片、免疫磁珠技术、化学发光技术相结合,以顺磁微球为抗体的固化载体,通过在芯片系统中构建电磁场来富集磁性微球,分离结合的抗原抗体复合物与游离的抗原和抗体,定位免疫反应,以达到微流控芯片重复使用的目的。二、基于顺磁微球的免疫分析试剂在微流系统中的应用1.选择鲁米诺-过氧化氢发光系统作为化学发光底物,研究温度、pH值、鲁米诺加入浓度、过氧化氢加入浓度对化学发光的影响,研制化学发光底物试剂。2.分别以TSH和T4为研究对象,研制适于在微流控芯片系统中使用的双抗夹心法和竞争法的试剂,并对试剂的可靠性进行验证。3.收集临床标本,使用建立的实验方法和自研制的一系列免疫试剂检测临床标本,将结果与罗氏E2010型电化学发光分析仪的检测结果进行统计分析。结果1.选择TSH抗体和羊抗兔IgG抗体的最佳工作浓度均为1:200,交联后通过测定,TSH抗体与聚苯乙烯磁性微球的交联率为52.92%,羊抗兔IgG抗体与聚苯乙烯磁性微球的交联率为48.6%。2.经过实验,固定鲁米诺-过氧化氢化学发光系统的最适反应pH值为9.6的碳酸盐缓冲液,最适温度为室温,过氧化氢反应的最佳加入浓度为0.1mol/L,鲁米诺反应的最佳加入浓度为5×10-5mol/L。3.采用微流控免疫分析芯片系统,用自行交联的TSH免疫磁珠和羊抗兔IgG抗体免疫磁珠试剂作为固化抗体的载体,成功对TSH进行了双抗夹心法免疫分析,对T4进行了免疫竞争法免疫分析。分析过程25min内完成,试剂加入量仅为10μl。测定TSH批内重复性实验平均CV为4.6%,天间重复性实验平均CV为4.7%,平均回收率为102.54%,准确性实验偏移系数为1.06%;测定T4批内重复性实验平均CV为4.9%,天间重复性实验平均CV为5.0%,平均回收率为106.26%,准确性实验偏移系数为3.19%。收集临床标本,本法与罗氏E2010型电化学发光法的检测结果平均符合率TSH为92.67%,T4为96.34%,将TSH和T4的检测结果分别与罗氏电化学发光法检测结果进行配对T检验,P值均＞0.05,认为两种方法的测定结果无显著性差异,结果一致,可以进行临床推广。结论1.优化发光底物鲁米诺使用条件,为研究相应试剂奠定基础。2.成功研制了适用于微流系统的双抗夹心法和免疫竞争法的试剂,其灵敏度、检测范围、重复性、稳定性等达到临床初步应用的要求,该试剂也完全适合于微流控系统使用。3.研制的试剂与微流系统结合,使检测速度更快,试剂成本低,操作简便,为研制进一步集成化微流免疫分析系统创造了条件。