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背景药物性肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)是指由各类处方或非处方的化学药物、生物制剂、中草药及其代谢产物乃至辅料等所诱发的肝损伤。DILI是最常见和最严重的药物不良反应之一,重者可致急性肝衰竭甚至死亡。药物诱导的肝损伤与宿主的遗传背景和免疫应答等有关。探索遗传因素与药物毒理之间的关系,以此来制定个体化用药方案,提高临床用药的精准性和安全性。胆汁酸是胆固醇在肝脏中氧化产生的类固醇分子,除了促进脂质吸收和维持胆固醇平衡外,还充当信号分子激活胆汁酸核受体FXR。胆汁酸通过激活法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)及其下游信号通路,不仅调节自身合成和肝肠循环,也影响肝脂质稳态。利福平可诱导胆汁淤积、脂肪变性及肝细胞损伤等。胆汁酸及胆汁酸核受体FXR在利福平诱导的肝损伤中的病理生理作用及机制仍然不清楚。目的探索核受体FXR与利福平诱导的肝损伤之间的关系,阐明FXR在利福平诱导肝损伤中的分子机制。方法1.FXR在利福平诱导急性肝脏损伤中的作用选取6-8周C57BL/6(Wildtype,WT)和FXR敲除(FXR-/-)雄性小鼠,分成四组,分别是 WT DMSO 组、WT 利福平组(200 mg/kg/d)、FXR-/-DMSO 组、FXR-/-福平组(200mg/kg/d)。连续给药1周,禁食6h麻醉采血,分离血清,处死后取肾脏、肝脏和小肠,样本过液氮速冻后置于-80℃。多功能酶标仪检测小鼠血清AST、ALT、ALP、TBIL和DBIL的水平;取肝脏,常规制备石蜡切片进行HE染色。2.FXR在利福平诱导的肝脏脂质毒性中的作用小鼠分组处理同上,麻醉取血后处死取肝脏组织,速冻后进行切片和油红O染色,显微镜下观察肝细胞中的脂滴。通过快速液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)凝胶过滤法分离血清脂蛋白,检测血清VLDL-C、LDL-C、HDL-C的水平。小鼠禁食4 h后尾注Tyloxapol,麻醉采血测血清甘油三酯的浓度来检测小鼠肝脏脂质分泌能力。提取肝组织RNA,QRT-PCR检测脂质代谢相关基因的表达水平。3.FXR在利福平诱导的胆汁淤积中的作用FXR在利福平诱导的胆汁淤积小鼠模型中的作用:小鼠分组处理同上,禁食期间收集小鼠的尿液和粪便。血清和尿液的胆汁酸浓度用酶标仪进行检测。肝脏、粪便、胆汁酸池分别在75%乙醇中匀浆破碎,溶解胆汁酸,离心后测上清中的胆汁酸水平。提取组织RNA,QRT-PCR检测小鼠胆汁酸代谢相关基因表达水平。Western blot检测小鼠胆汁酸代谢相关蛋白表达水平。在细胞模型中利福平对胆汁酸信号通路的影响:HepG2分别用DMSO、CDCA、CDCA和利福平组处理。提取细胞RNA,QRT-PCR检测胆汁酸代谢相关基因的表达水平。Western blot检测胆汁酸代谢相关蛋白的表达水平。结果1.FXR在利福平诱导急性肝损伤中的作用(1)血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平:利福平处理后 WT 和 FXR-/-小鼠 AST、ALT水平均升高,且FXR-/-利福平组比WT利福平组升高的更明显。(2)血清碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)水平、总胆红素(Total Bilirubin,TBIL)和直接胆红素(Direct Bilirubin,DBIL)浓度:利福平处理后WT和FXR-/-小鼠血清ALP水平、TBIL和DBIL浓度均升高,FXR-/-利福平组与WT利福平组相比无统计学差异。(3)肝脏形态:利福平处理后WT和FXR-/-小鼠均出现肝脏黄染、边缘变钝、体积增大,且FXR-/-利福平组比WT利福平组更严重。(4)苏木素伊红染色:利福平处理后,WT小鼠肝细胞仅轻微水肿,而FXR-/-小鼠肝细胞索排列紊乱、肝细胞严重水肿、脂肪变性,胞质苍白。2.FXR在利福平诱导的肝脏脂质毒性中的作用(1)小鼠油红O染色:利福平处理后WT和FXR-/-小鼠肝细胞中脂滴均增多,且FXR-/-利福平组比WT利福平组小鼠脂滴增多的更明显。(2)小鼠血清和肝脏脂质检测:血清胆固醇浓度:利福平处理后WT和FXR-/-小鼠血清胆固醇浓度均升高,且FXR-/-利福平组高于WT利福平组。肝脏胆固醇水平:WT利福平组肝脏胆固醇水平高于WT正常组;FXR-/-利福平组与FXR-/-正常组相比无统计学差异。血清甘油三酯浓度:WT利福平组血清甘油三酯浓度低于WT正常组;FXR-/-利福平组与FXR-/-正常组相比无统计学差异。肝脏甘油三酯水平:WT和FXR-/-小鼠利福平处理后肝脏甘油三酯水平均升高,且FXR-/-利福平组高于WT利福平组。(3)快速液相色谱分析:WT和FXR-/-小鼠利福平处理后血清VLDL-C、LDL-C、HDL-C浓度均升高,且FXR-/-利福平组小鼠高于WT利福平组。(4)肝脏脂质分泌:利福平处理后WT小鼠肝脏脂质分泌增多,而FXR-/-小鼠脂质分泌不变。3.FXR在利福平诱导的胆汁淤积中的作用(1)血清总胆汁酸浓度:利福平处理后WT和FXR-/-小鼠血清总胆汁酸浓度均升高,且FXR-/-利福平组高于WT利福平组。(2)肝脏胆汁酸水平:利福平处理后WT和FXR-/-小鼠肝脏总胆汁酸水平均升高,且FXR-/-利福平组高于WT利福平组。(3)尿液和粪便胆汁酸水平:WT和FXR-/-小鼠利福平处理后尿液胆汁酸水平均升高。WT和FXR-/-小鼠利福平处理后粪便胆汁酸水平均降低。(4)胆汁酸代谢相关基因的表达水平:利福平处理后,WT小鼠胆汁酸输出泵(Bile salt export pump,BSEP)的表达升高,胆固醇 7α 羟化酶(Cholesterol 7α hydroxylase,CYP7A1)基因的表达降低,但利福平处理后FXR-/-小鼠CYP7A1和BSEP基因的表达无变化。利福平处理后,WT和FXR-/-小鼠钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、有机阴离子转运多肽 1b1(Organic anion transporting polypeptide1b1,OATP1b1)基因的表达降低,多药抵抗相关蛋白 3(Multidrug resistance-associated protein3,MRP3)、细胞色素 P450 2B10(Cytochrome P450 2B10,CYP2B10)和细胞色素 P450 3A11(Cytochrome P450 3A11,CYP3A11)基因的表达升高。(5)胆汁酸代谢相关蛋白的表达水平:利福平处理后,WT小鼠的BSEP蛋白表达增强,而FXR-/-小鼠利福平处理后无变化。利福平处理后WT和FXR-/-小鼠磷酸化末端激酶(phosphorylation c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白表达水平均升高,且 FXR-/-利福平组高于WT利福平组。(6)在细胞模型中利福平对胆汁酸信号通路的影响:在高胆酸的条件下,利福平促进小异二聚体伴侣蛋白(Small heterodimer chaperone protein,SHP)、BSEP基因的表达,抑制CYP7A1基因的表达。结论1.FXR缺失对利福平诱导的肝损伤更严重。2.FXR缺失加重利福平诱导的肝脏脂质毒性。3.FXR活化促进BSEP的表达,从而减轻利福平诱导的胆汁淤积。