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乳酸杆菌的胞外成分S-层蛋白是细胞壁外的一类特殊蛋白,在细胞保护、粘附和聚集等方面具有多种功能。由于其与细胞表面结合的重要作用而受到重视。同时,肠道中存在大量游离脱氧核糖核酸(DNA),其具有强大的免疫刺激特性并可抑制促炎性因子的分泌。关于乳酸杆菌的S-层蛋白和DNA在细胞中的免疫作用很少被关注。因此本课题以脂多糖作为炎性刺激物,研究从Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L两种乳酸杆菌上分离的S-层蛋白和DNA在处理脂多糖诱导的HT-29细胞的免疫调节作用具有重要意义。采取5 mol/L和1 mol/L的Li Cl提取纯化S-层蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定,在45 k Da处出现单一条带;采用DNA试剂盒提取DNA,利用琼脂糖电泳和核酸仪定性定量分析。经CCK-8实验分析S-层蛋白、DNA以及LPS对HT-29细胞增殖的抑制率,最终确定作用时间为6 h,两种S-层蛋白的浓度为150μg/m L,两种DNA浓度为10μg/m L,LPS的浓度确定为9μg/m L。在倒置显微镜下观察研究DNA对细胞抑制率影响较小。采用ELISA法分析M5-L和Q8-L菌株的S-层蛋白和DNA对HT-29细胞上清液中的炎性因子的抑制作用,研究表明两种S-层蛋白均在不同程度对LPS表现出拮抗效果,减缓IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-18和IL-6的分泌;而两种菌株的DNA能够与LPS诱导的HT-29细胞产生叠加或拮抗作用,炎性因子的分泌水平差异显著。利用RT-PCR分析S-层蛋白和DNA处理细胞时炎性因子的基因水平表达,研究表明S-层蛋白的作用效果与蛋白水平一致,而DNA差异较大。最终确定采用M5-L S-层蛋白探究TLRs与NLRP3之间的免疫调节研究。采用RT-PCR对M5-L菌株的S-层蛋白对LPS刺激下的HT-29细胞的TLRs的基因水平分析以及流式细胞术对TLR4在蛋白水平进行分析。研究表明TLR2、TLR4、TLR6、TLR9的基因水平均有不同程度的上调,而TLR4的基因水平上调最为显著,TLR9的调控与LPS和DNA更为密切。研究发现TLR4经LPS进行信号传导,调控IL-1β的分泌水平,间接导致NLRP3活化,募集ASC以及Caspase-1,进行免疫调节。关于S-层蛋白对TLR4/NLRP3之间是否通过NF-κB等途径进行免疫调节,具体作用机制有待进一步探究。