三七总皂苷对顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响

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目的:研究三七总皂苷(Panax nonstaining saponins,PNS)对顺铂(CDDP)诱导的人肾近曲小管上皮细胞(Human proximal tubular epithelial cells,HK-2)氧化应激损伤以及线粒体自噬的作用及其机制,为改善顺铂在临床治疗时引起的肾损害提供依据。  方法:(1)确定顺铂的造模浓度:取对数生长期的HK-2细胞培养24h后,分别加入一浓度梯度的顺铂(1.56,3.12,6.25,12.5,25ug/mL)干预24小时后用CKK-8法检测细胞活力,结合镜下损伤细胞形态特征、以低于IC50的浓度为造模浓度。  (2)PNS的毒性试验及工作浓度确定:取对数生长期的HK-2细胞培养24h后,分别加入一浓度梯度的的PNS(0.39,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5g/L)干预24小时后用CCK-8法检测细胞活力。  (3)PNS对顺铂诱导HK-2细胞损伤模型的影响:取对数生长期的HK-2细胞培养24h后,给予顺铂(造模浓度)和PNS(工作浓度)分别干预1,3,6,12,24小时后用CKK-8法检测细胞活力,观察PNS对损伤的HK-2细胞的缓解作用,检测细胞氧化应激指标ROS、MDA含量及SOD活性,利用荧光显微镜观察膜电位(MMP)变化。  (4)PNS对顺铂诱导HK-2线粒体自噬水平的影响:在透射电镜(TEM)下观察药物干预6h后的HK-2细胞的线粒体形态,通过RT-qPCR检测关键因子低氧诱导因子(HIF-1α)的mRNA表达,利用免疫细胞化学法测定关键因子HIF-1α的蛋白水平,同时利用蛋白免疫印迹法测定自噬相关蛋白LC3、BNIP3、Beclin1的水平。  结果:1、顺铂的造模浓度为6.25ug/mL,PNS的工作浓度为6.25g/L。  2、PNS对顺铂诱导HK-2细胞损伤模型的影响:HK-2细胞暴露于顺铂3,6,12,24小时后,与正常组比较,CDDP组的细胞活性水平显著降低(P<0.05),随着顺铂干预时间的延长,HK-2细胞损伤程度逐渐加重,SOD活性和MMP降低,ROS及MDA水平升高;与CDDP组比较,CDDP+PNS组的细胞活性水平明显升高(P<0.05),HK-2细胞的线粒体损害明显改善,SOD酶活性和MMP升高,MDA、ROS水平降低。  3、PNS对顺铂诱导HK-2细胞线粒体自噬水平的影响:HK-2细胞暴露于顺铂后,与正常组比较,电镜可观察到CDDP组的HK-2细胞的线粒体损伤明显,HK-2细胞LC3、HIF-1α、BNIP3和Beclin1蛋白表达增加(P<0.05)。与CDDP组对比时,CDDP+PNS组细胞电镜下可观察到自噬体,上述的自噬相关的蛋白表达显著升高(P<0.05)。  结论:1、顺铂能诱导HK-2细胞氧化应激及线粒体损伤。PNS对顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤有缓解保护作用,同时说明HK-2细胞氧化应激损伤模型成功。  2、PNS可能通过增强HK-2细胞的保护性自噬而降低顺铂诱导的细胞氧化应激损害,其机制可能与HIF-1α介导的HK-2细胞线粒体自噬的信号转导通路HIF-1α/BNIP3/Beclin1相关。
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