炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种原因尚不明确的肠道慢性炎症性疾病,具有终身复发的倾向,主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)两种类型。研究证实IBD是结直肠癌发生的确切危险因素之一,病程10年、20年及30年的溃疡性结肠炎患者发生癌变的风险分别为1.2%、3.6%和14.4%,IBD患者平均发生结直肠癌危险度为普通人群的2-4倍,每年平均约有10-15%的IBD患者死于结直肠癌,这种由炎症导致的结直肠癌是IBD最为严重的并发症,严重威胁着人们的生命健康。而由炎症演变而来的结直肠癌与散发性结直肠癌相比,在发病机制、临床特征、病理类型等方面存在明显的不同,因此人们将由结肠炎演变而来的结直肠癌统称为炎症相关结肠癌(colitis-associated colorectal cancer,CAC)。炎症相关结直肠癌的发生通常需要经历“炎症→异型增生→癌”的过程,炎症是CAC发生的始动因素。作为参与炎症最重要炎症介质-肿瘤因子(Tumor necrosis factor,TNF),除了参与多种炎症性疾病和免疫相关疾病外,还参与了多种恶性肿瘤的发生和发展。研究证实TNF与肿瘤发生存在两面性:在炎症的初期,TNF可促进突变细胞凋亡、抑制肿瘤血管的生成,对肿瘤起到抑制作用;但当炎症持续存在时,TNF又反过来可导致基因突变、抑制凋亡、刺激血管生成,此外TNF还可与其他炎症因子共同构成炎症微环境,释放大量活性氧、一氧化氮等活性物质,进一步损伤细胞DNA、促进肿瘤新生血管的形成,从而对肿瘤起到促进作用。TL1A是近年来发现肿瘤坏死因子超家族的一员,是IBD的易感基因,TL1A可通过与DR3结合调节Th1、Th2、Th17等效应细胞功能调控适应性免疫,促进T细胞增殖和分化,并使炎症细胞向病变部位聚集,从而加重炎症的发展;阻断TL1A/DR3通路可明显减轻炎症反应,从而减轻或控制IBD的发生和发展。但TL1A在结直肠癌中的作用研究较少,我们团队前期的研究证实在散发性结直肠癌中,TL1A、DR3、DcR3表达呈现升高的趋势,DcR3在肿瘤组织中的过度表达将阻碍TL1A与DR3的结合,抑制机体正常的免疫监视及免疫杀伤作用,并调控细胞的凋亡,从而促进散发性结直肠癌的发生和发展,但TL1A与炎症相关结直肠癌关系尚无相关研究。为了阐明TL1A对炎症相关结直肠癌的作用,本实验首先应用淋系细胞高表达TL1A的转基因小鼠和具有相同遗传背景的野生型小鼠建立炎症相关结直肠癌的模型,观察TL1A是否参与了炎症相关结直肠癌的发生,其次通过慢病毒技术对TL1A基因进行敲低或过表达,观察TL1A对结直肠癌细胞株生物学行为的影响,最后探讨TL1A影响炎症相关结直肠癌发生和发展可能分子机制。第一部分TL1A在炎症相关结直肠癌小鼠模型中的作用目的:探讨TL1A是否参与炎症相关结直肠癌的发生和发展。方法:1.采用Real-time Q-PCR方法扩增TL1A DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测进行LCK-CD2-TL1A-GFP-transgenic小鼠的鉴定。2.通过腹腔内注射诱变剂AOM并饮用DSS建立炎症相关结直肠癌模型,将淋系细胞高表达TL1A的转基因小鼠(Tg)与C57BL/6 WT野生型小鼠(WT)随机分为control组和AOM+DSS组,共4组,每组10只。Control组给予正常饮食;而AOM+DSS组给予腹腔内注射AOM(12.5mg/Kg)后饮用2%DSS水,共饮用7天;随后14天饮用蒸馏水,以此为一个循环,共4个循环,于第84天处死动物。3.小鼠结肠炎症评估:包括体重、DAI、结肠长度、结肠形态学改变、病理评分。4.小鼠结肠肿瘤的评估:包括肿瘤的数目、直径、异型增生评分。结果:1.应用LCK-CD2-TL1A-GFP特定引物扩增小鼠DNA片段,凝胶成像显示在192 bp附近处可见较强的荧光信号,鉴定为转基因小鼠。2.与对照组比较,转基因小鼠和野生型小鼠AOM+DSS组小鼠体重均有减轻,DAI评分显著升高;AOM+DSS/Tg组较AOM+DSS/WT组炎症程度更重、体重下降更为明显,结肠长度明显缩短(7.00cm±0.97vs5.85±0.78cm P<0.05),DAI评分明显升高(2.3±0.76 vs 1.28±0.47,P<0.05)。3.AOM+DSS组与对照组比较,AOM+DSS组光镜下可见腺体扭曲变形,细胞大小不等,层次错乱、极性消失,杯状细胞减少,并出现细胞核增大,核分裂像增多,甚至出现正常结构消失等异型增生的表现,AOM+DSS/Tg较AOM+DSS/WT异型增生评分较高(2.75±0.5 vs1.70±0.8),两组比较具有统计学差异(P<0.05)。4.AOM+DSS/Tg组较AOM+DSS/WT组比较,AOM+DSS/Tg组小鼠结肠肿瘤的数目较多(3.50±1.19 vs 5.62±1.30,P<0.05),成瘤率高(88.9%vs 66.7%)。第二部分TL1A对结直肠癌细胞生物学行为的影响目的:应用慢病毒技术对TL1A基因进行敲低或者过表达,观察TL1A对结直肠癌细胞株生物学行为的影响,并应用裸鼠皮下成瘤实验,观察TL1A对结直肠癌细胞株皮下移植瘤形成的影响。方法:1.应用Real-time PCR对结直肠癌细胞株TL1A的表达量测定,筛选合适的结直肠癌细胞株进行细胞学功能学实验。2.应用慢病毒技术对筛选的结直肠癌细胞株进行转染,并应用Real-time PCR对转染的效率进行验证。3.应用CCK-8和细胞克隆形成验证TL1A对结肠癌细胞株增殖的影响。4.应用Transwell迁移、侵袭实验及划痕实验,观察TL1A对结直肠癌细胞株侵袭和迁移的影响。5.将转染慢病毒的结直肠癌细胞株皮下注射至裸鼠,观察小鼠皮下移植瘤形成的情况,并行免疫组织化学评价皮下移植瘤组织的增殖能力。结果:1.应用Real-time PCR对结直肠癌细胞株HCT15、SW480、DLD-1、LOVO、HT29、HCT116进行TL1A相关表达量的测定,结果提示HCT116和HT29 TL1A的相对表达量较高,SW480 TL1A相对表达量最低。因此将HCT116和HT29进行敲低TL1A基因,而将SW480结直肠癌细胞株进行过表达TL1A基因。2.TL1A促进结直肠癌细胞的增殖应用CCK-8实验证实HCT116和HT29结直肠癌细胞株在敲低TL1A后增殖能力明显下降(P<0.05),将结直肠癌细胞株SW480过表达TL1A后其增殖能力明显增强(P<0.05)。应用细胞克隆实验证实HCT116和HT29在敲低TL1A后增殖能力明显下降(P<0.05),将SW480过表达TL1A后细胞增殖能力明显增强(P<0.05)。3.TL1A促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移Transwell迁移、侵袭实验结果提示:HCT116和HT29在敲低TL1A基因后侵袭及迁移能力明显下降(0.21±0.01vs 0.28±0.01 P<0.05),将SW480过表达TL1A基因后细胞侵袭及迁移的能力明显增强(0.36±0.02vs 0.27±0.01 P<0.05)。划痕实验结果提示:HCT116和HT29在敲低TL1A基因创伤愈合速度明显减慢(P<0.05),将SW480过表达TL1A基因后创伤愈合速度明显加快(P<0.05)。4.TL1A促进HCT116细胞裸鼠皮下移植瘤的生长在裸鼠皮下成瘤移植瘤实验中,TL1A敲低组皮下移植瘤平均体积明显小于对照组(P<0.05),移植瘤行Ki-67免疫组化检测提示:转染LV-si-TNFSF15组Ki-67的阳性率明显高于对照组(P<0.05)。第三部分TL1A通过Wnt/β-catenin通路促进炎症相关结直肠癌的发生目的:探讨TL1A促进炎症相关结直肠癌发生可能的分子机制。方法:1.应用第一部分动物模型的小鼠肠道组织,行免疫组化和免疫荧光检测,比较TL1A过表达组β-catenin细胞核阳性个数及表达量的情况,并分析下游靶基因变化。2.应用慢病毒技术对结直肠癌细胞株进行TL1A敲低或过表达操作,并应用western blot方法测定β-catenin及下游靶基因的变化。3.应用β-catenin抑制剂(WIKI4)后,观察TL1A对β-catenin及下游靶基因的影响,验证TL1A是否通过β-catenin调控下游靶基因。结果:1.免疫荧光及免疫组织化学染色提示AOM+DSS/Tg组β-catenin阳性核细胞数较AOM+DSS/WT组明显增加,表达量明显升高(P<0.05),其下游靶基因c-myc、cyclin D1的表达量亦明显升高。2.对HCT116和HT29进行敲低TL1A基因后,β-catenin、c-myc、cyclin D1表达量均明显下降(P<0.05);而对SW480进行过表达TL1A后β-catenin、c-myc、cyclin D1表达量均明显升高(P<0.05)。3.将HCT116和HT29敲低TL1A基因后,再给予β-catenin的抑制剂WIKI4后下游靶基因c-myc、cyclin D1表达量下降更为明显;而SW480进行过表达TL1A,再给予β-catenin的抑制剂WIKI4后,c-myc、cyclin D1表达量出现先升高后降低的情况。TL1A升高c-myc、cyclin D1的效应可以被WIKI4所抵消。结论:1.在AOM+DSS模型,淋系细胞高表达TL1A的转基因小鼠炎症程度较重、异型增生评分较高,并且成瘤数目较多、成瘤率较高,提示TL1A促进了结直肠癌的发生和发展。2.TL1A可促进结直肠癌细胞株的增殖、侵袭和迁移。3.TL1A可能通过Wnt/β-catenin通路影响炎症相关结直肠癌的发生。