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[目的]
①研究纳米铝的制备及表征。
②纳米铝佐剂生物相容性评价。
③以纳米铝为肿瘤疫苗佐剂预防小鼠H<,22>肝癌的研究。
④以纳米铝为肿瘤疫苗佐剂治疗小鼠H22肝癌的研究。
[方法]
①采用微乳法制备纳米铝佐剂,运用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEMl、X射线衍射分析(x-ray diffraction,XRD)、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)、能谱仪(energy dispersive spectrometer,EDS)及图象分析等技术进行特征性研究;
②采用CCK-8实验、溶血试验、微核试验、小鼠LDso(median lethal dose)检测等方法评价纳米铝佐剂的生物相容性;
③采用体内试验计算肿瘤质量抑制率、CCK-8法测定细胞毒杀伤活性、ELISA法检测血清细胞因子(IL-4、IFN-γ)浓度等,并采用树突状细胞吞噬试验来探讨纳米佐剂吸附自体肿瘤疫苗作用的机制,综合这些指标来评价纳米铝肿瘤疫苗佐剂对小鼠H<,22>肝癌预防及治疗的免疫疗效研究。
[结果]
①制备的纳米铝佐剂表征:TEM检测显示纳米铝佐剂为近圆形、电子密度高、大小较一致、分散良好;图像分析仪粒径统计学分析其平均粒径约为100nm;EDS证实制备的纳米铝只含有Al与O两种元素;XRD显示制备的纳米粒子各衍射峰所对应的面间距(d值)与粉末衍射标准联合会(JCPDS)编制的代表物质为Al(OO)H<,3>的PDF(Powder Diffraction File)卡片d值吻合一致。
②L-929细胞CCK-8实验、溶血试验、微核实验证实纳米铝佐剂无溶血作用、毒性低及无致畸致突变作用、符合生物材料的安全性要求,小鼠LD<,50>检测发现纳米铝佐剂LD<,50>为10.33g/kg,具有较广的安全值范围。
③在预防实验中,纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的肿瘤质量抑瘤率分别为95.49%,明显高于其他组;细胞毒杀伤实验结果表明:当效靶比为100:1时,纳米铝佐剂吸附疫苗组仅与对照组的细胞毒杀伤活性有明显差异;而当效靶比为50:1与25:1时,纳米铝佐剂吸附疫苗组的细胞毒杀伤活性明显高于普通铝吸附自体肿瘤疫苗组、单纯肿瘤疫苗组以及对照组;纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的细胞因子IFN-γ的平均浓度分别为18.8±8.81pg/ml,明显高于其他各组,有统计学意义;而纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的细胞因子IL-4的水平均低于检出下限,明显低于浓度为7.53±1.90 pg/ml的阴性对照组。
④在治疗实验中,纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的肿瘤质量抑瘤率分别为80.1%,明显高于其他组;细胞毒实验结果表明:当效靶比为100:1时,纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组仅与对照组的细胞毒杀伤活性有明显差异;而当效靶比为50L1与25:1时,纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的细胞毒杀伤活性明显高于普通铝吸附自体肿瘤疫苗组、单纯肿瘤疫苗组以及对照组;纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的细胞因子IFN-γ的平均浓度分别为16.1±4.67pg/ml,明显高于其他各组,有统计学意义,而纳米铝佐剂吸附自体肿瘤疫苗组的细胞因子IL-4的水平低于检出下限,明显低于浓度为15.44±3.79pg/ml的对照组。同时相差显微镜下观察,纳米佐剂比较普通铝佐剂更易被树突细胞所吞噬,更易启动免疫反应的第一步。
[结论]
①应用微乳法己成功制备了纳米铝佐剂。
②制备的纳米铝佐剂具有良好的生物相容性、可以进一步用于抗肿瘤免疫疗法。
③在预防和治疗实验中,纳米铝佐剂吸附自体疫苗组体内抑瘤率、细胞毒杀伤活性以及血清中IFN-7的水平均明显高于其他各组,有统计学意义:而IL-4水平则明显低于对照组。表明纳米铝佐剂可加强体内的抗肿瘤免疫应答,并诱导Th细胞向Thl方向分化,有助于增强细胞免疫,改变了普通铝佐剂Thl方面的缺陷。同时纳米铝佐剂可更易被树突细胞所吞噬提示纳米佐剂可更有效地启动机体免疫反应。