【摘 要】
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鸡坏死性肠炎又称鸡肠毒血症,于1961年首次报道于英国,目前已成为家禽养殖中最重要的肠道疫病之一,严重危害养鸡业的发展。该病是一种由革兰氏阳性、厌氧、有芽孢的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C.perfringens）引起的疫病,该菌可产生多达17种的毒素,但单一毒素型菌株只能产生某些特定毒素,目前根据分泌毒素种类和致病性的不同,将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、
【基金项目】
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国家重点研发计划（项目编号:2017YFD0500400,2016YFD0501303）; 国家自然科学基金项目（项目编号:31872460）; 滁州市科技计划项目（项目编号:2019ZN003）; 安徽科技学院重点学科项目（项目编号:AKZDXK2015A04）; 广东省乡村振兴战略专项（项目编号:201817SY0003）; 广东省重点领域研究计划项目（项目编号:2019B020218004）
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鸡坏死性肠炎又称鸡肠毒血症,于1961年首次报道于英国,目前已成为家禽养殖中最重要的肠道疫病之一,严重危害养鸡业的发展。该病是一种由革兰氏阳性、厌氧、有芽孢的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C.perfringens）引起的疫病,该菌可产生多达17种的毒素,但单一毒素型菌株只能产生某些特定毒素,目前根据分泌毒素种类和致病性的不同,将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、F、G等七个毒素型。为优化产气荚膜梭菌的检测技术,本研究根据产气荚膜梭菌A、B、C、D、E、F、G七个型中均具有alpha（α,CPA）毒素,且不同毒素型产气荚膜梭菌所特有的毒素基因不同的特点,建立了荧光定量PCR检测产气荚膜梭菌的方法。选择各毒素型产气荚膜梭菌特有的毒素基因序列设计特异性引物,并合成质粒作为阳性模板,进行引物、质粒的梯度稀释、反应体系及反应条件的优化,并使用产气荚膜梭菌A、B、C、D、E等5株不同毒素型标准株对检测方法进行验证。结果显示,当各个毒素基因的引物浓度为300 nM时,核酸检测结果最为理想。对5株标准株的检测结果表明,5株不同类型的产气荚膜梭菌标准株中所特有的毒素基因均与相关文献报道中的一致,即本试验中所建立的检测产气荚膜梭菌并进行分型的荧光定量PCR方法切实可行。本研究对从广东省粤东（YD）、粤西（YX）、粤北（YB）、珠江三角洲（ZJ）四个地区采集到的共计600份地养肉鸡粪便样品进行核酸提取,并对提取到的600份核酸样品进行了 CPA毒素基因的检测,CPA结果阳性即可判定为产气荚膜梭菌。对CPA阳性样品进一步进行其他毒素基因的检测,进而对产气荚膜梭菌进行定型。检测到CPA阳性的粪便样品进行了细菌的分离培养与鉴定并对培养后的细菌再次进行了荧光定量PCR检测。对600份粪便核酸样品的检测结果显示CPA阳性率为26.5%（159/600）,其中YD、YX、YB、ZJ四个地区检测到CPA阳性的样品在总的CPA阳性样品中所占百分比分别为22.6%（36/159）、27.0%（43/159）、20.1%（32/159）、32%（48/159）,占采集样品的百分比为 24%（36/150）、28.7%（43/150）、21.3%（32/150）、32%（48/150）。对159份CPA阳性样品进行产气荚膜梭菌CPB、CPE、ETX、ITX、netB、tpeL毒素基因的检测,最终的检测结果表明159份样品中158份样品为A型产气荚膜梭菌,1份为G型产气荚膜梭菌（ZJC4-1）。对159份CPA阳性样品进行产气荚膜梭菌的分离与鉴定,结果与粪便的核酸检测结果一致,即158份样品中含有A型产气荚膜梭菌,1份样品中含有产气荚膜梭菌。由此可以得出广东省境内养鸡场中产气荚膜梭菌的感染是普遍存在的,其中珠江三角洲地区产气荚膜梭菌感染情况最为严重达到了32%,感染率最低的地区为粤北地区,但是依然有21.3%。对所有产气荚膜梭菌阳性的样品进行进一步的毒素基因分型鉴定,鉴定结果显示广东省境内规模化养鸡场中A型产气荚膜梭菌为优势菌群。这一系列结果都表明广东省不同地区产气荚膜梭菌毒素型的流行情况基本接近,A型产气荚膜梭菌是危害广东省养鸡业的重要病原。
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