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目的：建立成年大鼠肝卵圆细胞增殖模型，进一步进行卵圆细胞的分离、纯化、鉴定和培养；利用绿色荧光蛋白基因转染和荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色两种方法进行标记，比较两种方法标记细胞的可行性；随后选择较优标记方法标记的卵圆细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠，探索卵圆细胞移植治疗暴发性肝衰的可行性及有效性。
方法：健康成年雄性Wistar大鼠，二乙酰氨基芴按15mg/kg每天一次连续灌胃4天，第5天行标准的2/3肝切除术，术后继续灌胃11天建立大鼠卵圆细胞活化模型，取肝脏组织制备石蜡切片进行HE、免疫组织化学染色(一抗为抗大鼠卵圆细胞标记物-6、甲胎蛋白、白蛋白、增殖细胞核抗原)，观察卵圆细胞的增殖情况；利用改进的Seglen胶原酶原位灌注及Percoll密度梯度离心法分离、纯化卵圆细胞，倒置显微镜、电镜下观察细胞特点，免疫组化染色进行鉴定(同上)，将纯化的卵圆细胞置于CO<,2>培养箱培养；对首次传代的细胞，利用转染试剂Fugene HD将绿色荧光蛋白基因转染细胞及荧光染料CFDA-SE染色两种方法进行标记，荧光显微镜下观察标记效率及标记后细胞形态的改变、MTT比色法测定细胞增殖活性的改变，以此选择合适的标记方法；雌性Wistar大鼠随机分为治疗组和对照组，10％D-氨基半乳糖腹腔一次性注射制作暴发性肝功能衰竭大鼠模型，给药24小时后取已标记细胞悬液0.5ml(1×10<7>个/ml)于肝脏左叶注射移植，对照组注射同体积培养液，于移植前及移植后24小时、48小时、72小时、5天、7天取血测定生化指标，如白蛋白、总胆红素(TBil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。并取肝脏标本进行病理检查，于移植后3天、7天、14天、21天处死大鼠，制作肝脏冰冻切片，荧光显微镜下观察移植后细胞的分布。
结果：利用二乙酰氨基芴联合肝大部分切除方法成功建立大鼠成体肝卵圆细胞增殖模型，石蜡切片HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量卵圆细胞为主的小细胞增生灶，一抗为抗大鼠卵圆细胞标记-6、甲胎蛋白、增殖细胞核抗原进行免疫组化染色结果显示增生灶细胞表现为阳性信号；采用改进的Seglen胶原酶原位灌注法分离，所得细胞悬液经Percoll密度梯度离心分为3层，第三层细胞在倒置显微镜下观察胞体小、约为肝细胞大小的1/6～1/3左右，免疫组化、电镜观察具有肝卵圆细胞的特点，平均细胞收获量为(3.40±0.84)×10<6>，细胞活性率大于90％；细胞原代培养1周左右可见集落样生长，传代后成铺路石样生长。首次传代后细胞用绿色荧光蛋白转染后6小时，在荧光显微镜下可以观察到少量绿色荧光细胞，胞核、胞质均表达荧光蛋白，24小时表达明显增加，48到72小时达到高峰，但转染效率普遍较低，最高为10％；转染细胞传代培养，荧光强度逐渐降低，可维持一个月。而CFDA-SE染色可标记几乎所有细胞，且荧光强度较强，6～24小时，细胞荧光强度逐渐减弱，24小时以后细胞荧光强度变化不大；光镜下观察两种标记方法均可以引起极少量的细胞胞质萎缩、凋亡，而细胞增殖活性检测结果显示两种标记方法对细胞的增殖活性无明显影响。
选用CFDA-SE染色标记卵圆细胞，将之移植给暴发性肝功能衰竭大鼠，肝卵圆细胞移植组(治疗组)存活大鼠移植后48小时开始恢复进食、活动，一般情况逐渐改善，而培养液移植组(对照组)大鼠一般情况仍逐渐恶化，一直处于昏睡状态，至移植后4天左右，才逐渐好转。治疗组和对照组大鼠的生存率在移植12小时及24小时，并无明显差异(13/15vs14/15，10/15vs10/15)，而在48小时及72小时，生存率差别很大(9/15vs6/15，9/15vs4/15)。
生化指标显示肝卵圆细胞移植组(治疗组)细胞移植后24小时TBil、AST、ALT、ALB水平相对于移植前差异无统计学意义(P>0.05)，移植48小时及以后各时间点，ALT、AST、TBil水平明显下降，ALB水平明显升高，与移植前比较有显著统计学差异(P<0.01)；培养液注射组(对照组)移植后24小时、48小时、72小时血清ALT、AST、TBil水平逐渐升高，ALB水平逐渐降低，与移植前比较有显著差异(P<0.01)，各项水平在移植5天后有所改善，但与移植前0小时比较，差异仍有统计学意义；治疗组及对照组在细胞移植前及移植后24小时统计学分析无差异(P>0.05)，移植48小时及以后时间点，治疗组各项指标相对于对照组有明显改善，统计学分析有显著差异(P<0.01)。
病理结果显示治疗组存活72小时后肝细胞点状及小片状坏死，炎细胞浸润，其间有少量再生肝细胞，对照组则表现为肝细胞索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎细胞浸润。1、2周时治疗组再生肝细胞逐渐增多，卵圆形核的嗜碱性小细胞也逐渐增多，以汇管区、中央静脉周围及坏死区增殖明显，并向肝组织内延伸。荧光显微镜观察，细胞移植后72小时，大鼠肝脏冰冻切片可以观察到绿色荧光细胞集落，主要位于注射部位，荧光强度较强移植后第7天移植细胞的荧光强度相对减弱，但分布范围更广，在切片上可以见到多个绿色荧光细胞团，在2周、3周及对照组大鼠的肝脏标本中均未检测到绿色荧光细胞。
结论：采用二乙酰氨基芴灌胃联合肝大部分切除可以成功建立成年大鼠肝卵圆细胞增殖模型；改进的Seglen胶原酶原位灌注联合Percoll密度梯度离心可以分离、纯化卵圆细胞，所得细胞在形态特点、超微结构、免疫表型方面符合肝卵圆细胞的特点，原代培养1周左右可见集落样生长，传代后成铺路石样生长；绿色荧光蛋白转染细胞所获得的转染效率较低，而CFDA-SE染色可以标记几乎所有卵圆细胞，二者均可以引起极少量的细胞凋亡，而细胞总体增殖活性变化不大。CFDA-SE标记后的卵圆细胞移植后可以提高大鼠的存活率、改善移植48小时后的ALT、AST、TBil等生化指标和病理结果，荧光显微镜下观察到移植细胞的荧光强度逐渐降低，荧光细胞集落分布范围逐渐扩大，推测移植的卵圆细胞在肝衰大鼠体内发生增殖、并向有功能的肝细胞分化。