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目的本课题以“配体-受体”特异性结合为理论基础,根据人前列腺癌PC-3细胞高表达GnRH受体而正常前列腺组织不表达GnRH受体的特点,设计合成了一种全新的具有肿瘤靶向性的靶向药物,将甲氨蝶呤与GnRH配体通过共价偶联方式结合在一起,形成GnRH-MTX偶联物,然后通过体外细胞实验和体内药效学实验探讨了GnRH-MTX偶联物的抗肿瘤活性及其在体内分布特性,为寻找一种高效、低毒抗前列腺癌靶向药物奠定基础。方法1.首先以MTX和GnRH多肽为原料,通过两步反应制备合成出GnRH-MTX偶联物。然后通过一系列先进分析手段如核磁共振,液相色谱-质谱联用仪等手段对化合物GnRH-MTX的结构进行鉴定。2.以GnRH-MTX偶联物和游离MTX为受试物,通过CCK8法和流式细胞仪等手段,研究比较MTX偶联前后对人前列腺癌PC-3细胞株和人正常前列腺成纤维细胞HPrF细胞株的体外细胞毒性。3.利用PC-3细胞接种BALB/c裸鼠建立了前列腺癌荷瘤裸鼠动物模型,以此为实验动物模型,评价GnRH-MTX偶联物静脉给药对荷瘤(PC-3)裸鼠的抑瘤效果。4.建立MTX体内HPLC含量测定方法,然后再以荷瘤裸鼠为动物模型,以MTX和GnRH-MTX为受试药物,经过静脉给药后,测定荷瘤裸鼠各脏器的MTX含量,以两组动物的各脏器组织中MTX的含量高低为指标,评价GnRH-MTX是否具有前列腺癌靶向性。结果1.通过两步合成法成功的合成了GnRH-MTX偶联物,第一步活性酯反应条件如下：反应摩尔比为MTX:EDC.HCL:NHS:DMAP=2:6:6:1,在25℃、无水无氧和避光的条件下反应24小时,简单处理反应液,经硅胶柱色谱(v乙酸乙酯：V石油醚=1：6)分离提纯,反应产率为72.36%；第二步GnRH-MTX偶联物的反应条件是反应摩尔比为MTX活性酯：GnRH多肽=1.5：1,在25℃下反应4小时,反应终止时缓慢加入乙醚进行沉淀,终止反应,简单处理反应液后,将粗品通过反相制备液相色谱,纯化得到GnRH-MTX偶联靶向药物；化合物的色谱纯度为98.35%,终产物约1500 mg,反应产率为88.98%；同时经过MS测定化合物的分子量为1632,与理论值相符合；同时还用HNMR化合物进行了进一步的验证,确定合成所得到的产物与预期产物相吻合。2.CCK8实验结果显示,MTX偶联前后对PC-3细胞和对正常前列腺成纤维细胞HPrF细胞的细胞毒性,药物作用于细胞24小时,MTX对PC-3细胞的IC50为1.36μmol/L;GnRH-MTX偶联物对PC-3细胞的IC50为0.41μmol/L;而MTX对正常HPrF细胞的IC50为147.19 μmol/L, GnRH-MTX偶联物对正常HPrF细胞的IC50为93.63 μmol/L;同时利用流式细胞仪对检测了MTX及其偶联物作用于PC-3细胞后的细胞凋亡率,实验结果为：MTX组作用于细胞24小时,空白对照组PC-3细胞凋亡率为5.71%;浓度为0.24 μmol/L时,凋亡率为10.56%；浓度为0.98 μmol/L时,凋亡率为62.21%;浓度为3.91 μmol/L时,凋亡率为70.33%;GnRH-MTX组作用于细胞24小时,空白对照组PC-3细胞凋亡率为4.12%；浓度为0.24 μmol/L时,凋亡率为20.31%；浓度为0.98 μmol/L时,凋亡率为77.31%；浓度为3.91 μmol/L时,凋亡率为98.71%。随着给药浓度的增加,细胞凋亡率也增加。3.体内药效学实验表明：给药结束时,各组相对肿瘤增殖率(T/C)如下：比卡鲁胺组25.67%,甲氨蝶呤组36.85%,GnRH多肽组95.77%,低剂量组40.67%,中剂量组33.47%,高剂量组30.84%；给药结束时还通过剥离肿瘤块称重计算了肿瘤抑制率,各组肿瘤抑制率为：比卡鲁胺组的抑瘤率为：79.47%;甲氨蝶呤组的抑瘤率为：69.54%；多肽组的抑瘤率为：9.27%;而低、中和高剂量组抑瘤率分别为67.55%、76.82%和79.47%。相对肿瘤增殖率和和肿瘤抑制率等数据均表明MTX经过与GnRH偶联之后,抗前列腺癌效果提高了。4.建立了HPLC方法检测MTX在荷瘤裸鼠各脏器中的浓度,MTX能够与样品中的其他干扰物有效分离,该方法快速、灵敏度高和专属性好；靶向性实验研究结果：GnRH-MTX偶联物和游离MTX等摩尔注射给药后,游离MTX给药后在肿瘤组织中的药物浓度为4.27 mg/kg,而GnRH-MTX偶联物在肿瘤组织中的MTX浓度则为13.61 mg/kg,表明MTX经过偶联之后药物更具有肿瘤靶向性了。结论1. 以MTX和GnRH多肽为原料,通过两步合成法成功的合成了GnRH-MTX偶联物,反应操作简单,耗时少,反应条件温和,反应产率高。2.体外细胞学实验表明,GnRH-MTX偶联物对高表达GnRH受体的前列腺癌PC-3细胞抗肿瘤活性明显强于游离的MTX。3. GnRH-MTX偶联物能够有效抑制人前列腺癌PC-3裸鼠移植瘤的“疯狂”生长,GnRH-MTX偶联物的对荷瘤(PC-3)裸鼠的抑瘤效果较游离MTX的抑瘤效果有明显提高。4.MTX通过与GnRH多肽偶联之后,GnRH-MTX偶联物在荷瘤(PC-3)裸鼠体内具有肿瘤靶向性,药物在荷瘤裸鼠体内的组织分布也发生了变化。综上所述,GnRH配体可作为靶向药物的载体,将药物靶向递送至GnRH受体高表达的肿瘤细胞,起到减毒增效作用,实现肿瘤靶向治疗。此外,本论文还对米卡芬净钠进行了研究,建立了米卡芬净钠有关物质分析方法,液相色谱条件为：采用等度洗脱,色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 column (250×4.6 mm,5μm),流动相为磷酸盐缓冲液(1.2g磷酸二氢钠和6.15 g高氯酸钠溶于1000 mL超纯水中,用磷酸调节PH至2.9)：乙腈=62：38(V/V),流速为1.0 mL/min,柱温为45℃,检测波长为210 nm,进样量为10 μ L。并对该分析方法进行了方法学验证,验证项目包括系统适应性、专属性、定量限、检测限、线性、准确度、精密度、溶液稳定性和耐用性等。经验证,该方法专属性好、灵敏度高、线性范围好,回收率高,重现性好,耐用性好,该方法适用于米卡芬净钠原料药的有关物质测定：然后同时应用此方法对米卡芬净进行了强降解研究,在碱性条件下和氧化条件下较不稳定,在酸性条件下和光照条件下中等稳定,在水解条件和热降解条件下较为稳定。