水稻湿度敏感雄性不育基因的克隆和功能研究

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水稻的生殖发育是一个复杂的过程,其生殖过程包括雌雄配子的发育,花粉与柱头的识别萌发,花粉管的极性生长,精子和卵子结合等。任何一个步骤出现异常都将导致败育的发生。水稻花粉粒的发育包括花药的细胞分化,绒毡层细胞的发育和程序性降解,花粉壁的形成和淀粉粒的充实等连续的过程。花粉壁在植物有性生殖中扮演了一个非常重要的角色,发育过程复杂且受基因严格调控,相关基因的突变可能造成花粉粒发育失败。花粉粒发育过程中涉及脂质代谢和多糖类代谢调控。成熟花粉粒被包裹在多层的花粉壁内,因此,花粉壁对于花粉的功能很重要,它能使花粉粒抵御恶劣条件,如高温、紫外线、微生物攻击和水分流失,起到一个保护屏障的作用。到目前为止,人们对于水稻花粉壁的发育有了一定的了解,但对其完整的发育机制还有待进一步的研究。实验室在研究过程中发现了一个结实率降低的水稻突变体。本研究首先对突变体进行不同的环境条件(温度、光周期、湿度)处理后,发现突变体在低湿条件下结实率降低,高湿条件下结实基本恢复正常,所以,我们确定这是一个湿度敏感的突变体。突变体和野生型粳稻品种ZH11的正反交实验证明,突变体的不育是由于花粉粒不能正常萌发造成的,并且在体外干燥的环境中,花粉粒散出花粉后迅速失水死亡,所以,我们认为它是一个湿度敏感雄性不育突变体,并将其命名为humidity-sensitive genic male sterility1(hgms1)。hgms1突变体成熟花粉粒的KI-I2染色可染率达95%以上。在干燥条件下,hgms1突变体花粉由于快速失水而导致其在柱头上不能萌发,但在体外液体环境中能够正常萌发。通过对突变体花药的超薄切片观察发现,成熟花粉粒外壁间柱层减少且外壁外层和外壁内层间的含油层物质缺少。遗传分析表明,突变体的湿度敏感雄性不育受一对隐性基因控制。本研究通过图位克隆的方法,将hgms1定位在水稻3号染色体的一个80 kb的区间内,对区间内候选基因分析发现,其中一个编码长链脂肪酸合成酶的基因编码区出现8个碱基的插入,移码后造成预测蛋白翻译提前终止。我们将野生型的HGMS1片段转化到突变体中进行功能互补验证,恢复了hgms1突变体的表型。在ZH11背景下,通过RNAi干涉技术降低HGMS1的表达,模拟了hgms1突变体的表型。在黄华占背景下敲除HGMS1基因导致植株的结实率降低,表明HGMS1的表达与育性密切相关。过表达HGMS1,导致ZH11湿度敏感雄性不育,并且也是由于过表达植株散粉后花药快速失水导致的。qRT-PCR结果显示,HGMS1在整个花药发育过程中都有表达,在花药S10期表达量最高。原位杂交结果表明,HGMS1主要在花药绒毡层表达,尤其在S10期绒毡层中表达最高。亚细胞定位实验表明,HGMS1位于内质网上,因此可能在内质网上发挥重要作用。蜡质成分测定表明,花药中超长链脂肪酸(Very long chain fatty acid,VLCFAs)及其衍生物含量降低。花粉粒中结构的改变和脂质的含量降低,可能是导致花粉在体外容易失水的原因。论文研究结果表明,hgms1是湿度敏感雄性不育突变体,HGMS1基因可能参与绒毡层中超长链脂肪酸的合成与转运,其发育异常可能影响了花粉壁的结构发育和物质积累,造成花粉粒在干燥的环境中容易失水,导致其在柱头上不能顺利萌发。论文研究结果对研究花粉发育和脂质代谢具有重要意义;同时,湿度敏感雄性不育的研究丰富了对水稻环境敏感雄性不育的认识,具有重要理论意义和应用价值。
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