【摘 要】
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越来越多的证据表明一些Nlrp基因对于卵子发生,卵泡发生以及胚胎早期发育是至关重要的。Nlrp4e是Nlrp4基因在小鼠中的7个拷贝之一,基因复制被认为是进化的一种重要的驱动力。这
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越来越多的证据表明一些Nlrp基因对于卵子发生,卵泡发生以及胚胎早期发育是至关重要的。Nlrp4e是Nlrp4基因在小鼠中的7个拷贝之一,基因复制被认为是进化的一种重要的驱动力。这种进化包括产生新的基因和基因具有新的或者不同的功能。我们的研究表明Nlrp4e基因可能在小鼠生殖系统中发挥重要作用。通过实时定量PCR,免疫组织化学,蛋白免疫印记和免疫荧光共聚焦观察等一系列实验,我们确定了Nlrp4e基因在卵母细胞和附植前胚胎中的表达模式和蛋白定位,这对进一步研究该基因功能是重要的。研究表明Nlrp4e基因的信使RNA和蛋白产物在卵子发生的过程中逐步积累。其转录产物在受精后2细胞阶段出现明显波动,首先显著上调,接着又急剧减少以至几乎检测不到,蛋白产物也逐步减少至囊胚阶段,而2细胞阶段正是小鼠合子基因激活的重要时期。使用Cy3标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA)转染小鼠附植前胚胎,建立向小鼠附植前胚胎导入siRNA的电穿孔方法。通过控制透明带弱化程度、电压、脉冲时间和脉冲次数等条件,采用不同参数组合并结合使用不同介质作为电转缓冲液将Cy3标记的阴性对照siRNA转染小鼠附植前胚胎。在荧光倒置显微镜下,观察胚胎的存活率、siRNA转染率以及阳性转染存活胚胎的囊胚发育率。结果显示小鼠附植前胚胎在使用台氏液消化胚胎透明带10s后,以opti-MEM作为电转缓冲液,电穿孔参数设置为30V,1ms,3次的条件下取得最佳转染效果。在受精卵中采用RNA干扰技术对Nlrp4e基因进行干扰实验,结果导致受精卵在不同的siRNA浓度下相继阻滞在2细胞至8细胞阶段。然而在对生发泡时期的卵母细胞进行的RNA抑制实验中并未观测其减少对卵母细胞的成熟过程带来影响。为了研究该基因在缺少父源基因组的胚胎的发育中的作用,我们又对孤雌激活胚胎实施了以上实验。所有的实验结果表明Nlrp4e,作为一种母源-合子效应基因,其功能可能与卵子成熟无关,但是在受精卵的早期发育中可能扮演着重要角色。
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