研究背景心房颤动(简称房颤,atrial fibrillation, AF)是由于心房无序的颤动造成的严重的心房电活动紊乱,是目前临床工作中最常见的心律失常之一。房颤使得心房失去了有效的收缩与舒张,加之房室结对快速心房激动的递减传导引起的紊乱的心室率导致患者常出现胸闷、心悸等临床症状。房颤患者的主要病理生理特点为心室律(率)紊乱、心功能受损和心房附壁血栓形成,而栓塞、心力衰竭等并发症导致房颤患者的致残率和致死率大大增加,医疗花费也大大增加。迄今为止,房颤治疗效果依然不尽人意。药物治疗是房颤治疗的基石,射频消融术近年来随着其技术水平的提高,消融成功率也逐渐增高。然而,房颤治疗的长期有效性却由于传统抗心律失常药物的潜在副作用和射频消融术的高复发率特别是长期复发率偏高而备受限制,这与房颤发生的确切机制尚未完全阐明密切相关,也大大增加了房颤治疗的难度。房颤的发生机制十分复杂,房颤可导致心房电学和组织学特性发生改变,形成心房重构,包括早期的电重构和较晚期的结构重构,两者随着房颤进程而进展,互相影响又相互促进。近年研究表明,心脏自主神经系统(autonomic nervous system, ANS)是房颤的发生与维持中的重要环节,ANS包括外在ANS与内在ANS。越来越多的研究显示,心脏内在ANS的神经元及其神经纤维的过度再生及不均一分布即心脏内在自主神经重构(autonomic neural remodeling, ANR),参与了房颤的发生与维持,是房颤的重要发病机制。而且神经重构常常与电重构及结构重构并存,彼此相互促进,形成恶性循环,导致AF的发生并持续下去。房颤发生后,心房的自主神经重构随即产生。研究表明,包括交感神经和副交感神经重构在内的自主神经重构在房颤维持和易损基质的形成过程中起着重要作用。而对于房颤发生后心房自主神经重构的部位而言,目前关于房颤后心房神经重构的研究大多集中在左右心房的神经重构,而很少涉及房间隔。由于房间隔的两侧面为心内膜,中间又夹有结缔组织及肌束,其中位于房间隔下部右心房面的卵圆窝处主要由结缔组织构成,因此房间隔是极度不均一的特殊组织结构,其在房颤的发生中是否发生了神经重构,其与心房其他部位的神经重构程度是否存在差异性以及其在房颤发生中所起的作用尚不明确。他汀类药物作为目前广泛应用的调脂药物,具有抗炎、改善内皮功能、减轻心肌缺血再灌注损伤等多种不同作用,而近期他汀类药物对心律失常的防治作用已成为研究的热点,特别是其对房颤等房性心律失常的防治作用受到广泛关注,近期研究结果表明他汀类药物对心脏外科围手术期房颤具有显著的预防作用,但其作用机制仍不明确。他汀类药物是否能够改善或者逆转房颤的自主神经重构,这种改善或逆转的程度是否存在心房不同部位的差异性,以及其对房颤发生的抑制作用如何,目前尚无报道。据此,本研究应用心房快速起搏兔制作房颤模型,观察房颤兔模型心房各部位自主神经重构的特点及有无差异性,同时应用瑞舒伐他汀进行药物干预,观察他汀类药物对于房颤兔模型中心房各不同部位的自主神经重构的影响,并探讨其在房颤中的作用机制及疗效,为房颤治疗提供新的干预靶点,也为临床上他汀类药物防治房颤提供新的依据。研究目的本研究应用心房快速起搏兔制作房颤模型,观察房颤兔模型心房各部位自主神经重构、心房不同部位的自主神经重构有无差异性与房颤诱发率的变化以及瑞舒伐他汀钙对心房各部位自主神经重构的影响,试图探讨瑞舒伐他汀钙对房颤治疗的可能机制,为房颤治疗提供新的干预靶点。研究方法1.房颤兔模型的制作及实验分组1.1实验分组将健康新西兰大白兔30只随机分为对照组(C,n=10)、快速起搏组(P,n=10)、瑞舒伐他汀钙干预组(R,n=10)共三组。(1)对照组(C组)植入起搏器但不打开起搏器开关,喂养2周。(2)快速起搏组(P组)植入动物起搏器以600次／分快速起搏2周。(3)瑞舒伐他汀钙干预组(R组)以同样的方法起搏两周,同时术后给予瑞舒伐他汀钙(5mg/kg/d)灌胃2周,其余两组以安慰剂生理盐水灌胃2周。1.2房颤兔模型制作利用快速右心房起搏的方法制备房颤兔的动物模型。新西兰大白兔以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉麻醉后,颈部切开皮肤找到颈静脉,从颈静脉植入动物起搏器,起搏器电极经心内电生理仪标测至高位右房,在X线透视下固定电极,然后分离颈部皮肤制作囊袋,将起搏器放入囊袋中,庆大霉素冲洗囊袋,缝合皮肤,整个过程遵循无菌操作,术后青霉素抗感染3天。2.术前、术后心内电生理指标的测定术前经颈静脉植入标测电极,连接电生理仪,以S1S1 200ms, S1S2起始周长150ms,步长为-5ms,电压4V,测定心房的有效不应期(AERP)并以S1S1刺激观察房颤诱发率,术后2周再次测定AERP和房颤诱发率。术中应用多导电生理仪LEAD-7000持续进行标准Ⅱ导联心电监测和血压监测。3.心电图检测术前所有动物均应用心脏电生理仪检测心电图,术后每天进行体表心电图检查以确定有无房颤发生(检查时关闭起搏器开关),房颤发生以心电图出现至少持续30s以上的频率快、形态多变不规则的房颤波形为标准。4.免疫印记(Western-blot)测定由于胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase, CHAT)代表心脏中胆碱能神经的分布及其活性；络氨酸羟化酶(TH)阳性可代表心脏中交感神经的分布情况。2周后取左右心房及房间隔组织并以酪氨酸羟化酶(TH)及乙酰胆碱转移酶(CHAT)分别标记交感与副交感神经,应用Western-bot检测各组心肌组织标本中CHAT、TH蛋白表达情况,即获得心脏中胆碱能神经和交感神经的含量,从而明确各组动物心脏自主神经分布及含量。5.免疫组化测定通过免疫组化方法和Western-blotting对CHAT、TH阳性神经进行染色。测定交感神经和副交感神经形态、密度及分布,并使用计算机辅助形态计量分析系统(Image-Pro Plus 6.0)在高倍镜下进行神经密度分析和测量。统计学分析：应用SPSS17.0软件对所有数据资料进行统计学分析,计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验,多组间多部位比较采用重复测量设计的方差分析,各组间房颤诱发率的比较采用卡方检验,检验水准α=0.05,P值为双侧,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.心内电生理指标的测定结果起搏两周后,与C组比较,P组AERP缩短,且P组的房颤房颤诱发率显著增加(P<0.05),而R组AERP与房颤诱发率较C组比较无明显差异(P>0.05),但较P组AERP延长,房颤诱发率下降(P<0.05)。2.心电图检测结果应用多导电生理仪进行房颤诱发率检测及每日复查体表心电图发现,C组无自发性房颤或其他房性心律失常发生,P组所有接受右心房快速起搏兔中共有8只出现房颤,成功建立房颤模型。而R组经过2周瑞舒伐他汀钙干预后,仅1只兔子发生房颤(P<0.01)。3.免疫印记(Western-blot)测定结果蛋白质印迹法(Western blotting)显示,与C组相比,P组左右心房和房间隔的TH和CHAT蛋白表达量均明显增加(P<0.05),在起搏两周后P组左房、房间隔和右心房的TH和CHAT蛋白表达量均较C组升高2-4倍(P<0.05)。而R组经过两周的瑞舒伐他汀钙药物干预后,左房、房间隔和右房的交感神经和副交感神经的蛋白表达量虽仍高于C组,但较P组明显下降(P<0.05)。4.免疫组化测定结果免疫组化染色显示C组左心房、房间隔和右心房组织中TH与CHAT阳性的神经纤维密度无明显差异,但房间隔神经分布的不均一程度最大(P<0.05)；P组中左右心房和房间隔的TH与CHAT阳性神经纤维密度均显著高于C组,神经分布不均一程度显著增加(P<0.05),其中右心房>房间隔>左心房；而R组中TH和CHAT阳性神经纤维密度虽仍高于C组,但与P组相比则明显下降,神经分布不均一程度也降低(P<0.05),其中右心房和房间隔的神经密度下降更明显,大于左心房(P<0.05)。结论持续性快速右心房起搏可致兔心房不同部位出现非均一性神经重构并可能介导房颤的发生,瑞舒伐他汀钙具有逆转这种非均一性神经重构并抑制房颤发生的作用,推测瑞舒伐他汀钙抑制房颤可能与其逆转心房自主神经重构有关。