【摘 要】
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贵州有关岭牛、思南牛、威宁牛等优良地方黄牛品种资源,有研究表明它们均含有人体必需的8种氨基酸,是一种蛋白质含量高,脂肪含量较低的膳食肉品,深受人们喜爱,但这些地方品种具有体格偏小,生长速度缓慢等问题,在一定程度上影响了开发利用。故本试验以贵州地方黄牛(关岭牛、思南牛、威宁牛)为主要研究对象,以生长激素(GH)和生长激素受体(GHR)为候选基因,对GH、GHR两个基因进行多态性检测,分析两个基因SN
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贵州有关岭牛、思南牛、威宁牛等优良地方黄牛品种资源,有研究表明它们均含有人体必需的8种氨基酸,是一种蛋白质含量高,脂肪含量较低的膳食肉品,深受人们喜爱,但这些地方品种具有体格偏小,生长速度缓慢等问题,在一定程度上影响了开发利用。故本试验以贵州地方黄牛(关岭牛、思南牛、威宁牛)为主要研究对象,以生长激素(GH)和生长激素受体(GHR)为候选基因,对GH、GHR两个基因进行多态性检测,分析两个基因SNPs位点与贵州地方黄牛生长性状的相关性,对贵州地方黄牛骨骼肌相关组织GH和GHR基因的表达规律进行分析,克隆牛GH和GHR基因的CDS区,构建GH和GHR基因真核表达载体,转染关岭牛原代骨骼肌细胞,从细胞水平检测生长相关因子的表达水平及细胞增殖速率。旨在探索GH、GHR基因对贵州地方黄牛生长发育的影响机理,为贵州地方黄牛的选育和利用提供科学依据。研究结果如下:1、在贵州地方黄牛(关岭牛、思南牛、威宁牛)GH基因第5外显子均检测到2个SNPs,即Exon5-G1570C、Exon5-A1720C。GHR基因共检测出8个SNPs,分别为Exon9-C162T、Exon9-C201T、Exon9-G243C、Exon9-G383A、Exon9-A495T、Exon9-C622T、Exon9-C642T、Exon9-A650C,其中思南牛无Exon9-G243C。相关性分析显示,关岭牛中:GH基因Exon5-G1570C无显著性差异(P>0.05),而Exon5-A1720C基因型CC在体高、十字部高、胸围、腹围对AC和AA显著(P<0.05),在体斜长、坐骨端宽分别对AC或AA显著(P<0.05);思南牛中:Exon5-G1570C基因型GG在体高对GC和CC显著(P<0.05),而Exon5-A1720C基因型CC则在胸围对AA显著(P<0.05);威宁牛中:Exon5-G1570C基因型CC在体直长、胸围对GG显著,Exon5-A1720C基因型CC则在体直长、胸围、腰高、坐骨端宽对AA显著(P<0.05),而AC则在胸宽对AA显著(P<0.05)。GHR基因突变位点在关岭牛和思南牛中均未检测到差异显著,但在威宁牛中,发现Exon9-G243C基因型GC在胸围对GG和CC显著(P<0.05),Exon9-A650C基因型AA在体斜长、坐骨端宽对CC显著(P<0.05),在胸深对AC和CC显著(P<0.05),其余6个SNPs均不显著。表明Exon5-G1570C、Exon5-A1720C、Exon9-G243C、Exon9-A650C这4个SNPs对贵州地方黄牛生长性状具有显著影响,可能作为贵州地方黄牛生长发育的候选分子标记。遗传特性分析表明:除Exon5-A1720C位点在三个牛品种和Exon9-G243C位点在威宁牛中偏离Hardy-Weinberg平衡,其余SNPs均未偏离Hardy-Weinberg平衡,这可能是由于遗传漂变、突变或育种措施等原因导致Hardy-Weinberg不平衡。生物信息学分析表明:黄牛GH、GHR蛋白的相对分子质量分别为27385.45或70872.71、理论等电点为6.90或4.60、均属于跨膜蛋白、亲水性、稳定性较高。突变前后,除Exon9-G383A m RNA二级结构未发生改变,其余SNPs均发生改变。2、GH和GHR基因在贵州地方黄牛相关骨骼肌组织(腰大肌、背最长肌)中均检测到m RNA表达,且表达趋势趋于一致,三个牛品种的GH、GHR基因均高表达于腰大肌,表明GH、GHR基因的表达量与贵州地方黄牛腰大肌生长发育存在一定相关性。3、成功克隆关岭牛GH和GHR基因CDS区,构建p EGFP-N3-GH、p EGFP-N3-GHR真核表达载体,根据测序结果与NCBI的黄牛GH和GHR基因序列进行比较,结果表明成功构建p EGFP-N3-GH、p EGFP-N3-GHR真核表达载体,为细胞转染提供试验基础。4、成功分离纯化培养关岭牛原代骨骼肌细胞,转染重组质粒p EGFP-N3-GH、p EGFP-N3-GHR,利用q RT-PCR方法、CCK-8试剂分别检测转染前后牛骨骼肌细胞生长因子IGF-1、IGF-2 m RNA表达水平和细胞增殖速率,试验结果显示,超表达GH、GHR基因可极显著提高牛骨骼肌细胞生长关键因子IGF-1、IGF-2 m RNA表达量,且4个时期(6 h、12h、24h、48 h)超表达组细胞增殖速率明显高于空白组,达到差异极显著水平(P<0.01),说明GH、GHR基因可促进关岭牛骨骼肌细胞的增殖分化,对其具有正向调控作用。
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