论文部分内容阅读
精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs),是一类位于曲细精管基膜具有自我更新和分化能力的成体干细胞,也是存在于生物体内唯一能够传递遗传信息的成体干细胞。SSCs是精子发生的基础,既确保了精子源源不断的产生,又保证了雄性动物生命过程中的生殖基础,对于繁衍后代具有非常重要的作用。然而,目前大家畜SSCs体外分化体系尚未建立,SSCs从二倍体细胞分化成单倍体精子的分化机制尚不明确,需要进一步进行深入研究。在本次试验中,探究了维甲酸(RA)和骨形态生成蛋白4(BMP4)作为两种外源诱导分化因子,对于山羊SSCs体外诱导分化的影响。首先,通过机械分离法、两步酶法及差速贴壁获取纯度较高的SSCs;探究RA和BMP4诱导SSCs分化的最佳浓度和作用时间,构建SSCs体外分化体系;其次,利用Western blotting检测BMP4对于Smad和PI3K信号途径的影响,利用Real time PCR检测BMP4对于转录因子的影响;最后,检测RA对于BMP4基因以及受体的影响,利用Western blotting检测RA和BMP4联合添加对于Smad信号途径以及细胞周期蛋白的影响。本试验主要获得以下研究结果:1.本试验所采用的两步酶消化法和2 h～2 h～12 h差速贴壁法提纯山羊SSCs,免疫荧光染色结果显示纯化后的SSCs能够大量表达分子Maker CD90和PLZF。2.Real time PCR结果表明,基础培养液中单独添加50 ng/m L BMP4作用24 h或单独添加10 n M RA作用18 h能够均能达到调控SSCs分化的最佳效果(P<0.05)。3.基础培养液添加50 ng/m L BMP4,Smad和P-Smad蛋白在BMP4组的相对表达量为1.4和1.2,Smad途径下游基因ID2、ID3在BMP4组的相对表达量为1.6和1.9,均显著高于BMP4+Noggin组和对照组(基础培养液)(P<0.05);PI3K蛋白和P-PI3K蛋白在BMP4组的相对表达量为0.7和0.65,PI3K途径下游基因Etv5在BMP4组的相对表达量为0.6,显著低于BMP4+Noggin组和对照组(P<0.05),PI3K途径下游基因Bc16b在BMP4组的表达量低于BMP4+Noggin组和对照组,但无明显差异(P>0.05)。4.基础培养液中添加50 ng/m L BMP4,转录因子Sohlh2和Ngn3在BMP4组的相对表达量为1.3和1.2,显著高于BMP4+Noggin组和对照组(P<0.05)。FGF2和Pou3f1的表达量在BMP4组,BMP4+Noggin组和对照组,均无显著差异(P>0.05)。5.基础培养液中添加10 n M RA后,BMP4基因和ALK3基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。ALK6基因的表达量在12 h、24 h无明显差异(P>0.05)。6.Western blotting结果表明,P-Smad蛋白水平和细胞周期蛋白P21在RA+BMP4组的表达量显著高于RA+Noggin组、BMP4组和对照组(P<0.05);细胞周期蛋白P16的表达量在RA+BMP4组略高于其他组,但差异不显著(P>0.05)。综上,基础培养液单独添加50 ng/m L BMP4作用24 h或10 n M RA作用18 h均能达到调控山羊SSCs体外分化的最佳效果;BMP4主要是通过Smad、PI3K信号途径和调控转录因子的表达发挥诱导分化作用;RA能够通过促进BMP4的表达激活Smad信号途径发挥诱导分化作用。