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转基因植物的出现为改良和选育出高产作物品种开辟了一条新的道路,其中利用基因转化改良淀粉品质是植物转基因研究的热点之一。马铃薯块茎淀粉因其直链和支链分子多聚度高,淀粉粒大小差异大等原因其水溶液的粘度高于玉米和小麦,因而被广泛应用于纺织,建筑,石油开采等领域,但其淀粉含量低已成为了限制淀粉加工产业发展的瓶颈。
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)在细菌和高等植物中催化磷酸葡萄糖和PPi反应生成糖原或淀粉生物底物ADP-葡萄糖,该反应是淀粉生物合成的限速酶;研究显示,植物AGPase对昼夜周期调控敏感,在玉米中表达大肠杆菌编码AGPase的glgC基因,可提高其淀粉合成量。
为了通过提高AGPase活性增加块茎淀粉含量,同时相对提高支链淀粉含量,本实验室用大肠杆菌glgC、马铃薯GBSSIcDNA及其启动子构建了重组融合基因的植物转化载体pCB1,pCB2,pC-g和pC-gpg,但其马铃薯体内表达尚未完成。
本研究利用农杆菌介导的转基因方法,将目的重组基因转化马铃薯体内,获得转基因马铃薯抗性苗93株。抗性苗经过PCR的检测,获得33株阳性结果。PCR检测阳性的转化子的茎段进行GUS组织化学染色结果显示,GUS基因在12株转化子的茎段中得到表达。
以GUS染色阳性转化子的基因组DNA为模板,以地高辛标记的glgC基因的PCR产物为探针做Southern杂交,结果得到了不同转化子基因组中重组基因插入拷贝数,其中单拷贝转化子9株,双拷贝转化子2株,多拷贝转化子1株。
12株转化子AGPase酶活力以及淀粉含量测定及分析结果表明,转化子DXY-pCB2-2的AGPse酶活力显著高于对照及其它转化子,DXY-pCB1-2淀粉含量显著高于对照及其它转化子,研究初步确定了高淀粉和高酶活力的转化子,为进一步的筛选奠定了基础。
相关分析表明GUS阳性转化子AGPase活力和淀粉含量相关不显著,其中重组基因单拷贝插入转化子ZHB-PCB1-1,DXY-PCB1-2,DXY-PCB2-1,DXY-PCB2-2的AGPase活力和淀粉含量显著高于对照及其它转化子,室外条件下确认其AGPase活力和淀粉含量后,可作为进一步淀粉改良的种质。
最后,本研究建立了荧光发光反应测定ADP-葡萄糖焦磷酸酶活力方法,克服了传统的32p同位素方法的操作步骤繁琐,耗时较多,易污染等不足。尽管所建立方法经过反复实验确认其准确性,但在以后应用前需与传统的32p同位素方法进行比较研究,进一步确认其准确防止的问题,比较,荧光发光反应方法具有设备投资少,减少污染和简便易操作的优势。