家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus, BmBDV）是国际病毒分类委员会（ICTV）于2012年新设立的二分DNA病毒科中唯一的代表种。BmBDV 特异性侵染家蚕中肠柱状上皮细胞，病蚕体呈现软化、中肠柱状细胞浓核症、中肠中后部变黄等症状。病毒基因组包含两条线性ssDNA分子（VD1和VD2），分别独立包装于病毒衣壳中。VD1编码的主要结构蛋白VP以及VD2编码的次要结构蛋白P133在BmBDV侵染家蚕的过程中发挥着重要的作用。前期研究表明，对BmBDV敏感的家蚕品系中肠细胞中表达一个含有12个跨膜结构域的氨基酸转运蛋白NSD-2。而在对BmBDV具抗性的家蚕品系的中肠细胞中所表达的NSD-2蛋白则缺失一段跨膜区域，由此推测NSD-2蛋白可能为BmBDV感染宿主细胞的潜在受体。本研究的主要目的包括：①构建稳定表达完整NSD-2蛋白的家蚕卵巢细胞系BmN(+nsd-2)；②体外表达BmBDV结构蛋白VP以及P133，在BmN(+nsd-2)细胞系中研究病毒结构蛋白VP与NSD-2蛋白的相互作用；③研究BmN(+nsd-2)细胞系作为BmBDV体外感染敏感细胞系的潜力。　　本论文研究内容可分为以下三个部分：　　第一部分：构建稳定表达完整NSD-2蛋白的家蚕卵巢细胞系BmN(+nsd-2)。首先构建了表达BmBDV敏感性基因+nsd-2的质粒pIZ-+nsd-2并转染家蚕卵巢细胞BmN。利用pIZ-V5/His载体自带的Zeocin抗性筛选标记，对转染后的BmN细胞进行筛选。筛选传代30次后，获得稳定的家蚕细胞系BmN(+nsd-2)。通过western blotting和RT-PCR技术检测NSD-2蛋白的表达和+nsd-2基因的转录，结果显示在BmN(+nsd-2)细胞中能够检测到NSD-2蛋白的表达以及+nsd-2基因的转录；利用免疫荧光技术检测NSD-2蛋白在BmN(+nsd-2)细胞中的定位，结果显示NSD-2蛋白主要定位在BmN(+nsd-2)细胞的细胞膜上。　　第二部分：体外表达BmBDV结构蛋白VP以及P133，在BmN(+nsd-2)细胞系中研究病毒结构蛋白与 NSD-2 蛋白的相互作用。利用昆虫表达载体pIB/pIZ-V5/His构建表达病毒主要结构蛋白VP以及次要结构蛋白P133的表达质粒，分别转染BmN(+nsd-2)细胞。制备了主要结构蛋白VP单克隆抗体，并依据VP蛋白的β桶结构构建了表达不同长度vp基因的质粒。运用western blotting检测VP和P133蛋白的表达，结果显示在BmN(+nsd-2)细胞中均能检测到VP蛋白、P133蛋白以及NSD-2蛋白的表达。为了研究NSD-2蛋白与BmBDV主要结构蛋白VP间的相互作用，使用VP单克隆抗体能够检测到VP与NSD-2-V5融合蛋白共沉淀；其次使用V5标签多克隆抗体，可以检测到NSD-2-V5融合蛋白与VP蛋白的共沉淀；结果表明VP与NSD-2蛋白在BmN(+nsd-2)细胞中具有相互作用。利用免疫荧光的方法检测到VP与NSD-2蛋白在BmN(+ nsd-2)细胞中有共定位。这些研究结果显示NSD-2蛋白与BmBDV主要结构蛋白VP蛋白间存在相互作用。　　第三部分：研究BmN(+nsd-2)细胞系作为BmBDV体外感染敏感细胞系的潜力。以纯化的BmBDV病毒悬液（浓度：中肠肠干20 mg/mL）侵染BmN(+nsd-2)细胞。利用荧光定量PCR技术和免疫荧光技术检测BmBDV基因的转录以及病毒主要结构蛋白VP的表达，分析BmBDV对BmN(+nsd-2)细胞的侵染性。然而，在侵染的BmN(+nsd-2)细胞中免疫荧光实验并没有检测到病毒的入侵以及VP蛋白的表达；实时荧光定量PCR技术也没有检测到vp基因以及ns1基因的转录；暗示着BmBDV可能不入侵BmN(+ nsd-2)细胞或者不能在细胞内复制。　　综上所述，本研究成功构建了稳定表达BmBDV敏感性基因+ nsd-2的家蚕细胞系BmN(+ nsd-2)，潜在受体蛋白NSD-2与病毒主要结构蛋白VP间存在相互作用且在BmN(+ nsd-2)细胞中共定位；BmBDV可能不侵染BmN(+ nsd-2)细胞系，表明NSD-2蛋白是主要但并不是病毒的唯一受体。