背景与目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见高发于结直肠部位的消化道恶性肿瘤,作为世界四大癌症之一,每年全球发病人数超过100万。结直肠癌早期以手术治疗为首选,但早期症状不突出,待患者确诊时已属中晚期。因此,化疗和药物治疗为结肠癌患者延长生命、提高生活质量发挥着重要作用。然而,现有抗肿瘤化学治疗药物均有不同程度的毒副作用。在发挥治疗作用的同时,又侵害正常组织。并随着患者对现有化疗药产生耐药后,疗效显著下降。所以,对新型、低毒、高效、价廉的药物的研发是十分必要的。目前癌症常用药物,尽管有不同的靶位性和作用机制,但经临床反复用药,肿瘤细胞普遍出现耐药性。在现今结肠癌患病率逐年增高的情形下,研究一种能够抵抗耐药性并诱导结肠癌死亡的药物,阐释其作用机制具有重要的科学价值和临床意义。菊蒿作为一种传统的中草药,具有镇痛、抗菌及抗肿瘤作用,可治疗发热、偏头痛及关节痛。菊蒿含有多种药理活性成分,其中小白菊内酯(Parthenolide,PTL)是从菊科植物菊蒿中提取的一种倍半萜内酯化合物,近年来研究表明,小白菊内酯不但具有抗炎抗免疫的药理作用,还有较强的抗肿瘤活性,并可以增强肿瘤细胞对其他多种抗肿瘤药物的敏感性。小白菊内酯能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤。同时小白菊内酯亦可以诱导结肠癌细胞发生坏死,但小白菊内酯对正常小肠上皮细胞的作用及其诱导结肠癌细胞坏死机制尚不明确。鉴于此,本课题对小白菊内酯诱导结直肠癌细胞坏死及其调控机制进行研究。PGAM5(Phosphoglycerate mutase family member5)磷酸甘油酸变位酶5,PGAM5的激活可以导致成串排列的线粒体发生线性断裂,这一现象在细胞坏死发生的早期起到了非常重要的作用。PGAM5异常激活亦可以诱导ROS和TNF-a的产生,促使癌细胞坏死的形。而氧化酶NOX1是产生活性氧ROS的关键酶,NOX1感受胞外信息刺激时能够迅速催化生成高浓度ROS,高浓度ROS会诱导细胞发生炎症,甚至是坏死。PGAM5与NOX1蛋白与癌症细胞的坏死密切关联,但两者在促进结肠癌坏死机制中是否有存在相互作用,目前研究尚无报道。故本研究对小白菊内酯临床治疗结肠癌提供实验依据的同时,进一步阐释了PGAM5和NOX1蛋白在结肠癌坏死中所起的作用。方法1.小白菊内酯对结肠癌细胞和正常小肠上皮细胞活力的影响选用SW480、DLD1、HCT116三种结肠癌细胞和IEC-6正常小肠上皮细胞,37℃5%CO2培养。收集对数期细胞,调整细胞密度约10000/孔(96孔板)。待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的PTL (5μmol/L、10nmol/L、20μmol/L、40μmol/L,后表不为5μM、10μM、20μM、40μM),每孔100μl。每个浓度设4个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养6h、12h、24h、48h后,每孔中加入5mg/mL MTT20μL,继续培养4h。弃旧液,每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床振荡10min,至紫色结晶完全溶解。酶联免疫检测仪OD=490nm处测量吸光值。细胞生存率=试验组吸光度值/对照组吸光度值。实验重复3次后,统计分析。2.Hoechst33342/PI染色观察小白菊内酯作用结肠癌细胞后细胞核形态学变化细胞培养铺板方法见方法1,待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的PTL(10μM、20μM、40μM),每孔100μL。每个浓度设4个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养6h、12h、24h后。用PBS将20mg/mL Hoechst33342储存液制备成5-10μg/mL工作液。贴壁细胞弃培养基,用PBS清洗1-2次。每孔加入35μL Hoechst33342工作液,置于37℃温育15-20n血。弃Hoechst33342染液,PBS洗涤1-2次,加入50μg/mL的PI工作液,用荧光显微镜拍照分析统计。实验重复三次。3.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞坏死率SW480、DLD1、HCT116三种结肠癌细胞以1×105/孔L接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别加入浓度梯度的PTL (10μM、20μM、40μM),每孔2m1。设立空白对照组,给药后分别培养6h、12h、24h后,按照Annexin V/PI流式试剂盒说明书进行,采用美国Beckman公司EPICS XL分析型流式细胞仪进样测定,根据Annexin V-FITC(X)/PI (Y轴)荧光做对数散点图,可获得由4个象限组成的双参数图：左上象限(K1)为细胞收集过程中产生的损伤细胞,右上象限(K2)为晚期凋亡细胞和坏死细胞,左下象限(K3)为活细胞,右下象限(K4)为早期凋亡细胞,每个象限的细胞数即为受检总细胞数中所占的比例。实验重复3次。4.Western blot法分析小白菊内酯对caspase-3蛋白表达的影响SW480、DLD1、HCT116三种结肠癌细胞以1×105/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁后,分别加入20μM,40μMPTL,每孔2m1。设立空白对照组,给药后分别培养12h、24h后,Bradford法蛋白定量后,每组取约80μg蛋白样品,加入5倍上样缓冲液后进行12%SDS-PAGE,将湿转法转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h。一抗4℃孵育过夜。HRP偶联的相应二抗(1：1000稀释)室温孵育1h。然后利用KODAK Image Station4000MM Digital Imaging System进行化学发光法检测。5.MTT法检测z-VAD-FMK干预对小白菊内酯作用细胞活力影响三种结肠癌细胞用z-VAD-FMK预处理1h后,分别加入浓度梯度的PTL40μM),每孔100μL,每个浓度设4个复孔,同时设立单纯加药的空白对照组,给药后分别培养24h后,采用MTT法检测细胞活力。6.抗氧化抑制剂L-NAC干预的MTT实验和COX-2的western-blot实验检测小白菊内酯诱导结肠癌细胞是否发生炎症氧化应激反应三种结肠癌细胞用L-NAC预处理5h后,分别加入浓度梯度的PTL(10μM、20μM、40μM),每孔1001μL,每个浓度设4个复孔,同时设立单纯加药的空白对照组,给药后分别培养24h后,采用MTT法检测细胞活力。10μM、20μM、40μM PTL作用SW480细胞6h、12h、24h后,提取总蛋白用western-blot检测COX-2蛋白表达变化。7.Western blot法分析小白菊内酯对p53、β-catenin、PGAM5、NOX1等蛋白表达的影响,筛选出小白菊内酯诱导结肠癌细胞坏死的相关蛋白。10μM、20μM、40M三种浓度的PTL作用于三种结肠癌细胞6h、12h、24h后,提取细胞总蛋白,用western-blot方法检测与细胞死亡相关蛋白的表达。每组样品重复上样检测3次。曝光获取的图像用Molecular Imaging Software Version4.0(Kodak)进行蛋白条带灰度分析。8.PGAM5siRNA转染,观察小白菊内酯对细胞活力的影响转染PGAM5siRNA(P25S3UTR15L3UTR1),选用SW480、HCT116两种结肠癌细胞,收集对数期细胞,调整细胞密度约10000/孔(96孔板)。待细胞贴壁后,用Lipofectamine2000转染试剂,按试剂盒操作说明优化转染条件,分别将20nM、70nM的终浓度siRNA加入SW480、HCT116细胞培养液,孵育5h后换液,分别加入浓度梯度的PTL(10μM、20μM、40μM),每孔100μl。每个浓度设4个复孔,同时设立空白对照组,给药后分别培养6、12、24h后采用MTT方法检测细胞生存率。实验重复3次。9.转染PGAM5siRNA-5S3UTR1,观察小白菊内酯对结肠癌细胞NOX1蛋白表达的影响选用SW480、HCT116两种结肠癌细胞,收集对数期细胞,调整细胞密度约1×105/孔(6孔板)。待细胞贴壁后,用Lipofectamine2000转染试剂,按试剂盒操作说明操作,分别将20nM、70nM的终浓度siRNA加入细胞SW480、HCT116培养液中,孵育5h后换液,分别加入浓度梯度的PTL (0μM、20pM.40μM)),每孔2ml。同时设立空白对照组,给药后分别培养24h后提取总蛋白,用、vestern-blot方法检测NOX1蛋白表达差异。实验重复3次。10.Pull-down检测PGAM5和NOX1蛋白结合情况SW480细胞用PTL40μL作用24h后,提取细胞总蛋白(300μL RIPA裂解液/皿),空白组和加药组各取20μL冻存,作为western对照分析。剩余裂解液加入1μg PGAM5抗体,4℃360。摇床旋转过夜。第二日,加入45μL的protein A beads,4℃360。摇床旋转2-4h。4℃2500rpm离心15min,吸弃上清,用裂解液将beads清洗3-4遍,每次离心后弃上清。最后加入2×loading buffer上样缓冲液,98℃金属浴8-9min,取上清进行western-blot分析。11.统计方法采用SPSS13.0统计软件进行分析,结果表示为：均数±标准差(x±Sd)。组间比较单因素分析采用One Way-ANOVA,方差齐采用LSD法,方差不齐的采用Dunnett T3法；组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示具有统计学意义。结果1.小白菊内酯抑制结肠癌细胞生长5μM、10μM、20μM、的PTL作用SW480、DLD1、HCT116细胞6h、12h、24h、48h后,用MTT法检测细胞生存率。显示在6h,SW480、DLD1加药组间生存率没有差异性(P=0.102、P=0.053)；HCT116生存率在10μM、20μM、40μM显著降低,与空白组比较,具有显著性差异(P<0.01)；作用12h后,SW480、DLD1在浓度20μM和40μM与空白组比较,生存率显著下降(P<0.01、P<0.01)；HCT116被干预12h后,生存率进一步降低；24h后,SW480、DLD1、HCT116生存曲线基本趋于一致,浓度10μM、20μM、40μM的细胞生存率与空白组比较,生存率显著下降(P<0.01)。三种细胞在12h后,呈现明显的浓度梯度下调,并随着时间延长,生存率逐渐降低,具有时间、剂量依赖性。2小白菊内酯对正常小肠上皮细胞具有一定毒性,但药物敏感性低于结肠癌细胞MTT法检测PTL作用IEC-6细胞6h后,IEC-6生存率在40μM显著降低,与空白组比较,具有显著性差异(P<0.01)。PTL作用12h、24h后,IEC-6在浓度20μM和40μM与空白组比较,生存率显著下降(P<0.01、P<0.01)。PTL作用点24h-40μM,IEC-6生存率为0.517±0.025(x±S),而SW480、DLD1、HCT116在24h,PTL浓度为40μM时的生存率分别为0.305±0.019、0.154±0.008、0.241±0.021(x±S),均低于IEC-6生存率。说明PTL对正常IEC-6细胞具有一定毒性,但是敏感度远低于结肠癌细胞。3.小白菊内酯诱导结肠癌细胞膜破损,细胞核发生肿胀破碎统计Hoechst33342/PI荧光染色图中细胞PI着色率,在40μMPTL作用下,三种细胞的PI着色率显著高于空白组(P<0.01),尤其在药物作用24h后,SW480HCT116细胞核发生明显的肿大,而DLD1细胞核破碎。4.小白菊内酯提高结肠癌细胞坏死率小白菊内酯作用结肠癌细胞后,用流式细胞术检测细胞坏死率。在24h-20μM和24h-40μM,SW480细胞坏死率分别达到58.49%和66.56%,显著高于control组；DLD1细胞在24h-40μM PTL作用点上,细胞发生明显的坏死,坏死率达到21.94%。5小白菊内酯诱导结肠癌细胞的死亡非caspase依赖Western-blot结果显示,三组细胞caspase-3蛋白在17kd没有分体。z-VAD-FMK干预的MTT实验结果说明,z-VAD-FMK干预组和PTL单纯加药组间细胞生存率没有差异性(P>0.05)。6.小白菊内酯诱导结肠癌细胞发生炎症氧化应激反应电泳结果显示,与control组相比,12h-10μMPTL作用下,COX-2蛋白表达开始显著性升高。小白菊内酯可能诱导SW480结肠癌细胞发生炎症。抗氧化剂L-NAC预处理5h后,10μM、20μM、40μM的PTL分别作用于SW480、HCT116细胞6h、12h、24h。PTL作用12h、24h后,SW480L-NAC干预组在浓度20μM和40μM与空白组比较,生存率显著升高(P<0.01、P<0.05)；而HCT116L-NAC干预组在浓度40μM与空白组比较,生存率显著升高(P<0.05、P<0.01)。高浓度小白菊内酯能够诱导结肠癌细胞发生炎症氧化应激反应,最终导致死亡,这种死亡可以被抗氧化剂L-NAC抵抗。7.小白菊内酯诱导细胞坏死不通过p53,β-catenin为非共性蛋白,与NOX1蛋白密切关联。MTT实验结果显示,在40pM PTL作用24h后,p53+/+p53-/-HCT116细胞加药组间生存率没有差异性(P>0.05)。western-blot曝光条带灰度值分析显示,10μM、20μM、40μM PTL作用于SW480细胞6h、12h、24h后的p53蛋白表达没有差异性(P>0.05)。而P-catenin蛋白,SW480随着时间浓度的加大,P-catenin蛋白表达逐渐下调,与空白组比较具有显著差异性(P<0.05);DLD1细胞随着浓度时间的变化,β-catenin表达没有差异性；HCT116随着时间浓度的加大β-catenin蛋白表达逐渐上调(P<0.05)。三种结肠癌细胞均能在小白菊内酯作用下发生坏死,而β-catenin呈现三种不同的表达,说明β-catenin不是PTL诱导结肠癌细胞坏死的共性蛋白。与control组相比,SW480在6h-40μM时,NOX1表达开始显著升高,在6h-40μM时,SW480药后NOX1蛋白表达明显升高；DLD1和HCT116在12h-10μM时,NOX1表达开始显著升高。三种结肠癌细胞呈现相同趋势作用趋势,NOX1可能与小白菊内酯诱导结肠癌死亡相关。8.转染PGAM5siRNA后,结肠癌细胞对小白菊内酯的药物敏感性降低SW480和HCT116转染5L3UTR1和5S3UTR1后生存率升高,对药物的敏感度降低,尤为5S3UTR1转染后,10μM和20μM PTL作用细胞后生存率有显著性升高。提示PGAM5可能是小白菊内酯引起结肠癌细胞坏死的关键蛋白。9.转染PGAM5siRNA-5S3UTR1,NOX1蛋白表达降低。Knock down PGAM5后,小白菊内酯10μM、20μM、40μM作用结肠癌细胞SW480和HCT11624h,NOX1蛋白表达明显降低。说明PGAM5可能是启动NOX1的上游蛋白。10.PGAM5可以特异性与NOXl蛋白结合Pull-down实验证明,PGAM5可以特异性与NOX1蛋白结合,并在小白菊内酯干预后结合减少。结论1.小白菊内酯12h-20gM抑制人结肠癌细胞SW480、DLD1、HCT116肿瘤生长。2.小白菊内酯24h-40μM能诱导人结肠癌细胞SW480、DLD1、HCT116发生坏死。3.PGAM5是小白菊内酯诱导结肠癌坏死的关键蛋白。4小白菊内酯通过激活PGAM5,启动NOX1蛋白诱导炎症氧化应激反应产生,最终导致结肠癌细胞的坏死。