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目的：细胞增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene，HSG，又称线粒体融合蛋-2,Mfn2)是我国学者陈光慧利用差异显示技术对SHR和WKY大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell，VSMC)cDNA文库进行筛选得到的一个新基因。我们课题组的研究发现HSG可以通过影响cyclin E和p27表达，阻断ERK/MAPK信号通路而抑制VSMC增殖；免疫共沉淀和激光共聚焦分析显示，HSG蛋白以与SM<,α>-actin相互缔合的方式存在，提示HSG可能通过与actin相互作用而调节细胞骨架形成而参与VSMC 的分化过程。HSG是一种含有757个氨基酸残基的多结构域蛋白，其中包含疏水性跨膜区(599～644 aa)、p21共有模序(77～92 aa)、GTP结合区域(P环，98～117 aa)和PKA/PKG磷酸化位点(442位的丝氨酸)。每个结构域都行使不同的功能，但是哪个结构域可与actin相互作用及其相互作用的生物学意义尚不十分清楚。本研究分别构建HSG不同结构域的缺失突变体，进行体外沉降和聚合实验，观察HSG不同结构域在与actin相互结合中的结构基础并探讨其可能的机制。此外，我们还构建了HSG腺病毒表达载体，并成功在血管平滑肌细胞高效表达。
方法：
1、重组表达质粒的构建
以含有人HSG编码序列的pcD<,2>-HSG质粒(陈光慧教授惠赠)为模板，采用PCR扩增人HSG的全长及含有不同结构域编码序列的cDNA，在上、下游引物的5’端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。扩增产物经BamH I和EcoR I酶切后克隆到pGEX-3X原核表达质粒，构建可表达GST-HSG不同缺失突变融合蛋白重组质粒，命名为pGEX-3X-HSG(323-2596 bp)，pGEX-3X-HSG-1(323-1441bp)，pGEX-3X-HSG-2(1562-2116 bp)和pGEX-3X-HSG-3(1562-2596 bp)。
2、GST-HSG融合蛋白的诱导表达及分离纯化
2．1 GST-HSG融合蛋白的诱导表达
pGEX-3X-HSG-1，pGEX-3X-HSG-2和pGEX-3X-HSG-3转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)后，通过对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行筛选优化，确定GST-HSG融合蛋白诱导表达的最佳条件。在最佳条件下对pGEX-3X-HSG-1，pGEX-3X-HSG-2和pGEX-3X-HSG-3转化菌进行诱导培养后，将菌体裂解后离心，分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE检查融合蛋白在细胞内的存在形式。
2．2 GST-HSG融合蛋白的分离纯化
包含体经反复洗涤后，用十二烷基肌氨酸钠(SKL)进行变性溶解，变性后的融合蛋白经透析复性后，用GST-Sepharose 4B亲和层析进行纯化。
3 HSG与actin的相互作用的结构域基础
将GST-HSG1、GST-HSG2蛋白纯品与F-actin共孵育，Western blot检测沉淀中交联的F-actin。
4 HSG在细胞骨架重构中的作用
通过血清刺激/饥饿建立VSMC去分化/分化模型，应用蛋白分步提取和Western blot检测HSG在细胞中的分布。
结果：
1、重组质粒pGEX-3X-HSG的构建
内切酶图谱和测序结果显示，重组质粒pGEX-3X-HSG(323-2569 bp)，pGEX-3X-HSG-1(323-1441bp)，pGEX-3X-HSG-2(1562-2116bp)和pGEX-3X-HSG-3(1562-2596bp)中所插入的片段与预期长度一致，核苷酸序列正确无误。
2、GST-HSG融合蛋白的诱导表达
分别转化pGEX-3X-HSG-1，pGEX-3X-HSG-2和pGEX-3x-HSG-3的宿主菌经IPTG诱导后可表达约67kD、45KD和65KD的蛋白质，与融合蛋白分子量相一致，这些融合蛋白主要以包含体形式存在。在培养物(OD<,600>=1.5)按1：50接种于含0.1 mmol/L IPTG的LB培养液中，33℃诱导培养6 h的条件下，GST-HSG融合蛋白的表达量在菌体蛋白中所占比例最大，此条件作为GST-HSG融合蛋白诱导表达的最佳条件。
3、GST-HSG融合蛋白的纯化
包含体经反复洗涤，再经GST-Sepharose4B亲和层析纯化后，每100：ml培养物可得到约5 mg GSVT-SG融合蛋白，融合蛋白经Kada ID软件扫描分析纯度为90％。
4、GST-HSG1和GST-HSG2融合蛋白与等比例F-actin共孵育，未出现明显的促进F-actin沉降和交联的作用。改变融合蛋白GST-HSG1，GST-HSG2与actin的比例，发现随着GST-HSG/actin比例增加，GST-HSG1促进F-actin的交联活性增强，而GST-HSG2无明显的作用。
5、与血清刺激组相比，血清饥饿培养的VSMC中，HSG蛋白总量有所增加，但其在G-actin和F-actin组分中的分布没有差异。
结论：
1．成功构建了pGEX-3X-HSG(323-2596 bp)，pGEX-3X-HSG-1(323-1441 bp)，pGEX-3X-HSG-2(1562-2116 bp)和pGEX-3X-HSG-3(1562-2596 bp)原核表达质粒。
2．经过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件进行优化，GST-HSG1、GST-HSG2和GST-HSG3融合蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。
3．经过对包含体进行溶解与复性后，表达产物经GST-Sepharose 4B亲和层析得到电泳纯的GST-HSG1，GST-HSG2和GST-HSG3融合蛋白。
4．GST-HSG1参与F-actin聚合和交联过程，二者能否发生相互作用与GST-HSGl与actin的比例有关。