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[研究目的]建立稳定可靠的大鼠肝纤维化动物模型,观察经淫羊藿素灌胃给药后大鼠肝功能指标的改变及肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表达的变化,并在此基础上分离培养大鼠原代肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs),探讨淫羊藿素对原代HSCs活化的抑制作用。[研究方法]体内实验:通过胆管结扎(Bile duct ligation,BDL)和四氯化碳(CCl4)诱导的方法,分别建立胆汁淤积性和化学损伤性大鼠肝纤维化动物模型。在肝纤维化形成后,给予大鼠灌胃淫羊藿素治疗,给药剂量为1 mg/kg体重,治疗时间为3次/周,共持续4周。治疗完成后,从大鼠股动脉取血检测肝功能指标的变化,取肝组织行病理切片,通过HE染色观察大鼠肝脏损伤情况,通过免疫组化染色半定量分析肝组织内α-SMA染色阳性的活化型HSCs的分布和表达程度,分析淫羊藿素对由胆汁淤积和化学损伤引起的大鼠肝纤维化的缓解作用。数据通过统计软件SPSS 16.0进行处理,结果以x_±s.d.表示,组间均数差异比较采用方差分析(One-way ANOVA)检验,P<0.05为差异具有统计学意义。体外实验:通过胶原酶原位灌注消化,Nycodenz密度梯度离心的方法分离大鼠原代HSCs,并进行细胞培养及特性鉴定。以不同浓度的淫羊藿素溶液处理大鼠原代HSCs,应用噻唑蓝比色法(MTT法)检测不同浓度淫羊藿素溶液对大鼠原代HSCs活化的抑制作用,通过免疫组化染色半定量分析方法分析不同浓度的淫羊藿素溶液对大鼠原代HSCs中α-SMA表达变化的影响。数据通过统计软件SPSS 16.0进行处理,结果以x_±s.d.表示,组间差异比较采用方差分析检验,方差非齐性采用非参数检验,P<0.05为差异具有统计学意义。[实验结果]体内实验显示:采用BDL方法建立的胆汁淤积性大鼠肝纤维化动物模型肉眼可见肝脏肿大呈棕黄色,表面细颗粒状,部分模型有大量黄绿色腹水;HE染色光镜下见正常肝小叶结构破坏,胆管增生伴胆管内胆汁淤积明显,造模末期可见纤维组织包绕肝小叶并形成明显的纤维间隔。采用CCl4腹腔注射诱导的化学损伤性大鼠肝纤维化模型肉眼可见肝脏肿大呈暗红色,肝脏表面呈油腻感,部分模型腹腔内有淡黄色积液;HE染色光镜下观察肝细胞水肿、脂肪变性明显,随造模时间延长,肝组织内有炎性细胞浸润,同时有大量胶原纤维组织增生并破坏肝小叶结构,造模末期有假小叶形成。经过灌胃淫羊藿素治疗,与模型组相比,治疗组大鼠的肝功能各项指标较模型组均有所好转,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化染色半定量分析的结果表明,模型组的炎症区域附近有大量α-SMA染色阳性的活化型HSCs存在,而淫羊藿素治疗组的活化型HSCs的细胞数量则显著下降(P<0.05)。体外实验:通过胶原酶原位灌注,Nycodenz密度梯度离心的方法分离获得大鼠原代HSCs,每只大鼠肝脏的细胞得率为3-4×107个,经台盼蓝拒染实验判定细胞活率在90%以上,通过荧光显微镜观察可见在328 nm波长的激发光下刚分离到的HSCs自发绿色荧光。取细胞爬片,进行α-SMA免疫组化染色,判定细胞纯度达95%以上。分离培养大鼠原代HSCs,用1-64μmol/L浓度倍比稀释的淫羊藿素溶液作用原代HSCs细胞48 h后,可见原代HSCs的增殖受到明显抑制,其抑制率随淫羊藿素浓度的增加而递增。绘制淫羊藿素作用12 h、24 h、48 h后大鼠原代HSCs的生长抑制曲线,可见随淫羊藿素作用时间的延长,细胞抑制率相应升高,并以16μmol/L作用48 h后的抑制效果最为明显。分别用16、32、48μmol/L的淫羊藿素溶液处理大鼠原代HSCs,作用48 h后行α-SMA免疫组化染色半定量分析,α-SMA染色阳性的面积占总面积的百分比分别为34.31±12.68、36.72±10.68、30.25±11.58,与对照组70.24±20.46相比差异显著(P<0.05)。[结论]1.淫羊藿素可以缓解大鼠胆汁淤积性肝纤维化和CCl4诱导的化学损伤性肝纤维化的进程,改善肝功能。2.淫羊藿素降低了模型动物纤维化肝组织中升高的α-SMA的表达,抑制了纤维化肝组织中HSCs的活化。3.原代分离的大鼠HSCs具有活化型HSCs的生物学特性,是体外研究HSCs的一个重要模型。4.淫羊藿素可以抑制大鼠原代HSCs活化,这种抑制细胞活化增殖的效应可能是淫羊藿素抗肝纤维化的机制之一。