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1.研究背景目前,肿瘤已经成为当前医学难以解决的难题之一,而乳腺癌则是女性发病率与死亡率排名第一的恶性肿瘤。乳腺癌患者常面临各种生理、心理压力,而长期暴露于慢性压力下,患者交感神经系统过度兴奋,可导致机体内环境稳态紊乱,激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,促进儿茶酚胺类激素过度分泌进而影响肿瘤进展。肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小群具有自我更新、无限增殖及多项分化潜能并能够激活和重构肿瘤组织表型的肿瘤细胞。肿瘤干性标志物是研究肿瘤干细胞的重要靶点,MYC蛋白作为最早发现的肿瘤干性因子之一,研究其在肿瘤中的表达及具体作用机制,有利于为肿瘤患者提供新的临床诊疗方案。分子动力学是以物理,数学和化学为基础,依靠牛顿力学来模拟分子体系的运动,从不同状态的分子体系构成的系统中抽取样本,从而计算体系的构型积分,并以构型积分的结果为基础进一步计算体系的热力学量和其他宏观性质的综合性的模拟方法。利用分子动力学模拟技术能够帮助我们认识生物大分子结构与功能之间的联系,探索分子间的相互作用,以便于更准确的理解分子结构和功能之间的内在关联。2.研究方法(1)(1)通过实时定量PCR实验证明肾上腺素处理后乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MCF-7)MYC基因m RNA含量变化;(2)利用Western blot实验检测加入肾上腺素后乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MCF-7)MYC蛋白表达水平;(3)利用Western blot实验检测肾上腺素及放线菌酮处理后乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MCF-7)MYC蛋白水平变化;(4)利用Western blot实验检测肾上腺素及蛋白酶体抑制剂MG132处理后乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MCF-7)MYC蛋白表达水平变化;(5)泛素化实验检测肾上腺素及蛋白酶体抑制剂MG132处理后HEK293T细胞MYC蛋白泛素化水平变化。(2)(1)使用Western blot实验检测不同质粒转染及加肾上腺素处理后,乳腺癌细胞(MDA-MB-231)MYC蛋白表达水平;(2)利用Western blot实验检验敲低USP28后,乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中USP28及MYC的蛋白表达水平;(3)利用Western blot实验验证敲低USP28后加肾上腺素处理,乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中USP28及MYC的蛋白表达水平;(4)利用Western blot实验检验过表达USP28蛋白后加肾上腺素处理,乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中USP28及MYC的蛋白表达水平;(5)泛素化检测敲低USP28蛋白同时加入肾上腺素处理后,HEK293T细胞中MYC蛋白泛素化水平变化。(3)(1)免疫共沉淀实验验证USP28蛋白与MYC蛋白结合情况;(2)分子动力学模拟实验检测MYC蛋白与USP28蛋白结合位点;(3)泛素化实验检验HEK293T细胞中,转染野生型与突变型USP28蛋白后,加入肾上腺素处理后MYC蛋白泛素化水平变化情况。(4)(1)利用Western blot实验检测患者正常组织及肿瘤组织USP28蛋白及MYC蛋白表达水平;(2)免疫组化实验检测乳腺癌患者肾上腺素分泌高低两组患者组织中USP28及MYC的蛋白表达水平;(3)分析USP28蛋白与MYC蛋白表达量与患者预后的相关性。3.研究结果(1)(1)实时定量PCR结果显示,肾上腺素并不影响MYC基因RNA水平;(2)根据Western blot结果,肾上腺素促进乳腺癌细胞MYC蛋白的表达;(3)结合Western blot结果,肾上腺素能显著延长MYC蛋白的半衰期;(4)根据Western blot结果,MG132显著增强MYC蛋白表达,而肾上腺素不能影响MG132对MYC蛋白的作用;(5)泛素化实验结果显示,MG132显著增强MYC蛋白的泛素化水平,而肾上腺素能够逆转MG132引起的MYC蛋白泛素化增强现象。(2)(1)根据Western blot结果,肾上腺素稳定MYC蛋白水平是通过去泛素化酶USP28;(2)根据Western blot结果,去泛素化酶USP28的敲低可导致MYC蛋白表达降低;(3)根据Western blot结果,去泛素化酶USP28的敲低可逆转肾上腺素对MYC蛋白表达的促进作用;(4)根据Western blot结果,过表达去泛素化酶USP28可模拟肾上腺素对MYC蛋白表达的促进作用;(5)泛素化实验结果显示肾上腺素能够减弱由敲低去泛素化酶引起的泛素化水平升高的现象。(3)(1)免疫共沉淀实验现象表明,去泛素化酶USP28能够与MYC蛋白结合;(2)分子动力学模拟实验表明去泛素化酶USP28的催化中心能够与MYC蛋白结合;(3)泛素化实验结果显示高表达突变型USP28不能模拟高表达野生型USP28促进MYC蛋白的去泛素化现象。(4)(1)根据Western blot实验现象,乳腺癌患者肿瘤组织中USP28蛋白及MYC蛋白的表达较正常组织更高;(2)免疫组化实验结果表明乳腺癌患者中,肾上腺素高组患者组织USP28蛋白及MYC蛋白显著高于肾上腺素低组患者;(3)生存期实验结果表明USP28蛋白及MYC蛋白表达水平与乳腺癌患者预后呈现负相关。4.研究结论(1)乳腺癌中肾上腺素通过去泛素化作用稳定MYC蛋白表达;(2)USP28介导肾上腺素对MYC蛋白的去泛素化作用;(3)利用分子动力学模拟揭示USP28与MYC蛋白的结合位点;(4)USP28与MYC蛋白表达和乳腺癌患者预后呈负相关。