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目的:纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)广泛用于化妆品和防晒剂中。越来越多的证据表明ZnO NPs会对人体皮肤产生不可忽视的有害作用,但是对ZnO NPs毒性作用的潜在分子机制仍然知之甚少。先前的研究表明,氧化应激和自噬反应与ZnO NPs诱导的毒性有关。核因子-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,NRF2)是细胞内抗氧防御系统的关键核转录因子。NRF2通路已被认为是介导化学物致皮肤损伤的重要保护途径。当前的研究旨在探讨NRF2介导的抗氧化通路可能参与ZnO NPs致人角质形成细胞毒性的作用。研究方法:1.应用透射电镜技术观察ZnO NPs的形状及粒径,并利用动态光散射仪检测ZnO NPs的流体动力学直径以及Zeta电位;2.利用CCK-8试剂盒和乳酸脱氢酶LDH试剂盒检测ZnO NPs(0-500μM)染毒24小时HaCaT细胞的存活率及LDH漏出率,并使用流式细胞仪检测ZnO NPs对HaCaT细胞的活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)及线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)的影响;利用Real-time qPCR技术检测HaCaT细胞中自噬相关基因P62、LC3 II/I的mRNA表达,同时利用Western Blot技术对P62、LC3 II/I蛋白表达进行定量分析;3.应用Real-time qPCR技术对HaCaT细胞ZnO NPs处理后NRF2的下游基因HO-1、GCLC及GCLM的表达进行检测,并利用Western Blot技术检测NRF2和KEAP1蛋白的表达;4.应用慢病毒转染系统对HaCaT细胞进行转导,建立稳转沉默NRF2的Ha CaT细胞,并利用Western Blot技术检测NRF2蛋白表达水平进行验证;5.对Scramble和NRF2-KD的HaCaT细胞进行ZnO NPs处理后利用CCK-8试剂盒检测细胞活力,并检测ROS及MMP的变化;并利用Western Blot技术对Scramble和NRF2-KD的HaCaT细胞中自噬相关基因P62、LC3 II/I的蛋白表达进行定量分析;6.同时利用Real-time qPCR技术检测Scramble和NRF2-KD的HaCaT细胞在ZnO NPs处理后NRF2下游的抗氧化基因HO-1、GCLC及GCLM的mRNA表达并进行定量分析;7.应用透射电镜技术检测Scramble和NRF2-KD的HaCaT细胞ZnO NPs处理后细胞超微结构的变化,观察自噬溶酶体及自噬空泡的数量;8.应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)预处理HaCaT细胞,再加入ZnO NPs处理,检测自噬相关蛋白表达、细胞存活率和细胞内ROS表达的变化。结果:1.利用不同浓度ZnO NPs对Ha CaT细胞处理24小时,引起细胞活力降低和LDH泄漏,ZnO NPs以剂量和时间依赖性方式影响细胞活力,显著增加ROS水平,并引起MMP丧失;ZnO NPs处理Ha CaT细胞后引起NRF2蛋白表达增加,KEAP1表达降低,并且NRF2通路的下游抗氧化基因被激活,例如HO-1、GCLC和GCLM;2.ZnO NPs暴露后,与Scramble细胞相比,NRF2-KD细胞活力及MMP显著降低,ROS生成显著增加,同时NRF2下游抗氧化基因表达受到抑制;用ZnO NPs处理Scramble与NRF2-KD的HaCaT细胞的透射电镜结果显示,与同样处理条件下Scramble细胞相比,NRF2-KD细胞中观察到自噬空泡的数量显著增加;3.ZnO NPs在HaCaT细胞中诱导自噬反应,自噬相关蛋白LC3 II/I和P62均增加,自噬抑制剂3-MA预处理后,自噬相关蛋白LC3 II/I的表达降低,细胞活力升高,3-MA能够减轻纳米氧化锌诱导的细胞死亡。结论:1.HaCaT细胞暴露于ZnO NPs会促进ROS的积累,线粒体膜电位降低,NRF2的核易位,KEAP1蛋白水平的降低,NRF2通路下游抗氧化基因表达升高,LC3 II/I和P62的自噬标志物的增加。2.NRF2沉默会增加ZnO NPs诱导的氧化损伤和线粒体功能障碍,并显著增强HaCaT细胞的自噬水平,自噬抑制剂3-MA预处理后会减轻ZnO NPs诱导的细胞死亡。3.通过扰动NRF2通路能够调控ZnO NPs诱导的HaCaT细胞的毒性作用、氧化应激以及自噬反应。