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SOST基因(Sclerostin,SOST)编码硬化蛋白,是由骨细胞特异性分泌的含“胱氨酸结”的糖蛋白,它通过结合到LRP5/6复合体,抑制经典Wnt/β-catenin信号,负调控骨形成。硬化蛋白单克隆抗体已经在临床上用于治疗骨质疏松症。骨质疏松症关联基因的蛋白互作网络分析揭示SOST是一个重要的hub蛋白。本研究的目的:①探讨SOST基因的进化,②SOST基因SNP功能的计算分析,③miRNA和激素对SOST基因表达的调控研究。1、利用BLAST和MEGA4对SOST基因进行进化分析发现,SOST基因从sostdc1a进化而来,在圆口纲动物七鳃鳗中开始出现。蛋白序列比对发现SOST蛋白最早在头索动物文昌鱼中表达,在脊索动物中特异性表达且在脊椎动物的物种间高度保守。2、NCBI数据库中SOST相关SNP有463个,利用JASPAR对基因上游SNP进行转录因子预测分析发现12个SNPs会影响RUNX2等多种与成骨相关的转录因子结合;用SIFT、PolyPhen和I-Mutant Suite对非同义SNPs进行分析,鉴定出rs372515234和rs200581535可影响SOST蛋白质的结构、功能和活性;用MirSNP、PolymiRTS 和 miRNASNPv2.0 分析发现 SOST 3’UTR 区影响 miRNA 结合的 SNPs 13个。利用TargetScan预测调控SOST的天然miRNA主要结合在SOST3’UTR四个区域。3、利用双荧光素酶报告基因检测系统证明rs75901553(C/T)可以影响miR-98与SOOT的互作。分别转染rs75901553不同等位基因型的质粒到293T和U-20S细胞中,检测其在U-20S细胞中结合型C等位基因的转录丰度明显低于T。经鉴定293T和U-20S细胞中此SNP位点基因型均为C。在293T细胞中转入rs75901553不同等位基因型的质粒,采用qRT-PCR在mRNA水平检测到内源SOST的差异表达;将表达的miR-98载体转染到293T细胞,SOST表达量下调,说明rs75901553等位基因由C变为T,miR-98与SOST基因3’UTR的结合能力变弱,SOST的表达增加。在U-20S细胞中转染miR-98模拟物后SOST表达受抑制,转染miR-98抑制剂后SOST表达上调,说明miR-98可以靶向抑制SOST的表达。4、以骨肉瘤细胞为材料,用10 nM E2分别处理SAOS-2细胞9 h、12 h后,qRT-PCR检测miR-98的表达量分别上调了 4.82倍和1.73倍。使用50 nM PTH分别处理SAOS-2细胞12 h、16 h,miR-98的表达量分别上调2.58倍和5.64倍。雌激素和甲状旁腺素可通过上调miR-98的表达抑制SOST的表达。