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研究背景缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点,严重危害人类健康。目前,临床上治疗缺血性脑卒中的最有效的手段是通过血管内介入取栓或药物溶栓,使梗塞血管再通,恢复脑组织的血氧供给。然而,血流再通引起的缺血再灌注会对脑缺血区造成二次损伤,称之为脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion,CIR)。CIR的机制非常复杂,最新的研究发现,极化为M2型的小胶质细胞能够回输至缺血性脑卒中小鼠脑内能够减少梗死面积,并发现外泌体(exosomes)可能参与了起保护作用,近年来研究发现microRNA(miRNA)在其中发挥了重要的作用。miRNA是长度为20-24个核苷酸的单链结构,与其靶基因mRNA的3’非编码区结合,通过抑制翻译和促进mRNA的降解而抑制靶基因的表达。由于目前对于外泌体来源的miRNA在脑缺血损伤中的作用,尤其小胶质细胞来源的miRNA还知之甚少,我们考虑M2型小胶质细胞释放的exosomes中miRNA是否对CIR诱导的神经元凋亡具有保护作用,是否保护神经元轴突并修复损伤,其作用机制是什么,本论文就这些问题展开研究。目的和意义本研究基于M2型小胶质细胞在CIR中具有的神经保护作用,通过生物信息学分析发现潜在的靶向miRNA-mmu-miR-124-3p,进而验证mmu-miR-124-3p通过抑制ROCK2影响ROCK/pMLC/Caspase3通路从而抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡,同时通过抑制RNF38,抑制神经轴突损伤,为CIR的机制提供新的认识,为CIR的防治提供新的靶点和策略。方法我们利用生物信息学方法,深入分析脑缺血再灌注组与对照组鼠脑组织样本中的差异基因表达,利用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)分别构建M1型和M2型小胶质细胞模型,提取和鉴定exosomes,进而提取exosomes中RNA进行大通量实时荧光定量PCR(qPCR array)方法分析,从而筛选出M1型与M2型小胶质细胞BV-2外泌体内含物中差异表达的miRNA。我们使用HT-22细胞构建OGD模型,分析miRNA表达差异,我们选择HT-22细胞构建的OGD模型加入差异表达的miRNA mimics,利用CCK-8试剂盒、LDH试剂盒、流式细胞术,检测细胞生存率、LDH活力和细胞凋亡率的改变。我们利用生物信息学方法和双荧光素酶实验确定ROCK2为mmu-miR-124-3p的靶标,使用Western Blotting方法检测,干预mmu-miR-124-3p后,观察预测通路中相关蛋白的改变,利用生物信息学方法和双荧光素酶实验确定RNF38为mmu-miR-124-3p的靶标,利用PC12细胞构建OGD模型,干预mmu-miR-124-3p后,使用免疫荧光和Western Blotting方法,观察神经轴突再生相关蛋白的改变。结果(1)动物造模后,我们进行皮层组织测序分析发现,在TC RNA-seq测序与AGO结合测序中呈现出200个差异性表达的miRNA与mRNA,筛选结果可知ROCK2 mRNA翻录水平处于离散边缘,通过TC RNA-seq测序,我们发现ROCK2 mRNA在模型组中高表达而在对照组中低表达;通过AGO测序,我们发现ROCK2 mRNA翻录水平在模型组中非结合模式多于结合模式,而对照组相反,提示AGO测序结果与TC RNA-seq结果相符合。测序中我们发现在TC RNA-seq测序中,mmu-miR-124-3p在模型组高表达而在对照组低表达;而在A GO结合能力测序中,我们发现mmu-miR-124-3p在模型组中多数未被结合而低表达,而在对照组中因被结合减少则高表达,mmu-miR-124-3p含量增加抑制能力增强。(2)我们使用流式细胞术检测得M1型小胶质细胞达到86.7%的分型率,M 2型小胶质细胞达到90.3%的分型率。我们提取外泌体后,通过透射电镜鉴定外泌体形态,观察到所得颗粒大小均一,粒径范围集中在100 nm,符合外泌体特征;Western Blotting检测外泌体特征标志物CD63、Tsg101、CD81与Hsp70特异性表达,细胞标志物GAPDH则不表达,提示所得物质为外泌体。(3)我们发现mmu-miR-124-3p在M2型小胶质细胞分泌的外泌体(M2-EXO)中高表达,而在M1型小胶质细胞分泌的外泌体(M1-EXO)中相对低表达;比较非造模和OGD造模情况下HT-22细胞中miRNA的表达,我们发现mmu-miR-124-3p变化不明显,说明在造模条件下自身神经元细胞HT-22的mmu-miR-124-3p不参与或者相对低表达不起保护作用。我们给予100 nM浓度的mmu-miR-124-3p刺激,发现提高了 OGD造模下HT-22神经细胞的生存率,降低了细胞凋亡率。(4)本研究确定了 ROCK2 为 mmu-miR-124-3p 的靶基因。mmu-miR-124-3p通过抑制ROCK2蛋白的表达,从而抑制下游蛋白MMP2、MMP9、pMLC、Cleaved Caspase9、Cleaved Caspase3、Cleaved PARP的表达,发挥抑制神经元细胞凋亡的作用。(5)我们验证了 mmu-miR-124-3p mimic可通过抑制RNF38蛋白的表达,促进NREP的释放,影响神经轴突再生相关蛋白β-tubulin-Ⅲ、NF200、GAP43,发挥抑制神经元轴突损伤的作用。结论本研究我们发现M2-EXO可能是通过释放mmu-miR-124-3p发挥逆转OGD后的神经元凋亡作用的,同时证实mmu-miR-124-3p可通过抑制ROCK2蛋白的表达,影响ROCK/pMLC/Caspase3通路而发挥抑制神经元细胞凋亡的作用,并通过抑制RNF38蛋白的表达,促进NREP的释放,影响神经轴突再生相关蛋白β-tubulin-Ⅲ、NF200、GAP43,抑制氧糖剥夺造成的神经元轴突损伤。