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帕金森病(Parkinson`s disease PD)是以黑质纹状体系统多巴胺(dopamine DA)能神经元的进行性变性缺失和路易小体形成为特征的一种常见的中老年人神经系统变性疾病。服用左旋多巴类制剂的多巴胺替代疗法至今仍是最为有效的治疗方法,但远期疗效甚差,出现症状波动、异动症以及精神症状等。细胞移植是治疗帕金森病的研究热点之一。骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)可诱导分化形成神经干细胞、神经元、胶质细胞,分泌脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)等多种神经营养因子,为解决细胞移植的供体带来新的途径。6-羟多巴胺(6hydroxydopamine,6-OHDA)结构与多巴胺(dopamine,DA)结构相类似,常被误作为DA摄入DA能神经元,产生羟自由基,诱导细胞氧化应激反应和抑制线粒体氧化呼吸链复合物I和IV等,选择性地破坏DA能神经元,造成DA能神经元死亡。还原型谷胱甘肽(reducedglutathione ,GSH)是人类细胞质中自然合成的一种肽,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成,含有巯基(-SH),广泛分布于体内各器官,在维持细胞生物功能中有重要作用。作为脑内最重要的抗氧化保护剂, GSH具有清除自由基、保护线粒体等多种生物学功能。N-乙酰半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine,NAC)是GSH的前体,含有活性巯基,能转化为GSH,具有清除自由基,发挥抗氧化应激作用等多种生物学功能。作为帕金森病动物模型的常用药物——6-OHDA对骨髓基质细胞是否具有毒性作用,具有抗氧化作用的还原型谷胱甘肽和其前体N-乙酰半胱氨酸是否能减轻6-OHDA对骨髓基质细胞的毒性作用,发挥细胞保护作用,尚未见报道。本实验就此进行了研究。第一部分还原型谷胱甘肽拮抗6-羟多巴胺对骨髓基质细胞的毒性作用目的:探讨6羟基多巴胺(6-OHDA)对骨髓基质细胞(BMSCs)的毒性作用及还原型谷胱甘肽(GSH)对其的拮抗作用。方法:取60~90克SD大鼠的的股骨、胫骨以及肱骨BMSCs,体外培养至传三代。采用MTT法检测不同剂量6-OHDA对细胞的毒性作用,相同条件下同时检测GSH的细胞保护作用。MTT法检测分四组:第一组,PBS对照组,加入等量PBS;第二组,GSH组(终浓度分别为0.5、1、1.5、2.25、3、6、12 mg/ml) ;第三组,6-OHDA组(终浓度分别为0.05、0.1 mg/ml);第四组,GSH +6-OHDA组,6-OHDA(0.05 mg/ml)+ GSH(0.5、1 mg/ml), 6-OHDA(0.1 mg/ml)+ GSH(0.5、1 mg/ml)。结果:MTT显示GSH可使传三代BMSCs活性升高(p<0.05);6-OHDA可使传三代BMSCs的活性下降(p<0.05);GSH干预能够提高6-OHDA作用后的传三代BMSCs的活性(p<0.05)。结论:一定剂量的6-OHDA对BMSCs具有毒性作用。GSH能够明显拮抗6-OHDA对BMSCs的毒性作用。第二部分N-乙酰半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽对骨髓基质细胞活性的影响目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)对骨髓基质细胞活性的影响。方法:取60~90克SD大鼠的的股骨、胫骨以及肱骨BMSCs,体外培养至传三代。采用MTT法检测NAC和GSSG的细胞保护作用。MTT法检测分三组:第一组,PBS对照组,加入等量PBS;第二组,NAC组(终浓度分别为0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 mg/ml);第三组,GSSG组(终浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、3、6、12mg/ml)。结果:MTT显示NAC可使传三代BMSCs活性升高(p<0.05);氧化型谷胱甘肽浓度为0.05mg/ml时,GSSG组细胞活性高于PBS对照组(P<0.05)。随着GSSG剂量加大,细胞活性下降,呈剂量依赖性,当GSSG≥1.5mg/ml时,细胞活性低于PBS对照组(p<0.05)。结论:一定剂量的NAC能够明显升高BMSCs的活性。较低浓度的GSSG升高BMSCs的活性,高浓度的GSSG降低BMSCs的活性。结论1.一定剂量的6-OHDA对BMSCs具有毒性作用。2. GSH能够明显拮抗6-OHDA对BMSCs的毒性作用。3.一定剂量的NAC能够明显升高BMSCs的活性。4.较低浓度的GSSG升高BMSCs的活性,高浓度的GSSG降低BMSCs的活性。