胶原蛋白由三条多肽链缠绕折叠成三股螺旋,进一步通过组装、交联等方式形成胶原纤维、胶原网状蛋白等高阶结构蛋白,作为生物材料在组织工程等领域具有广泛的应用前景。为了降低动物组织提取可能引发的疾病传播风险,研究人员采用微生物重组表达的方式生产胶原蛋白,然而在重组胶原蛋白的生产中如何促进重组胶原分子交联,使其形成更加稳定的空间结构是设计重组胶原纳米材料需要克服的难点。本课题以来源于Streptococcus pyogenes的胶原蛋白为对象进行序列设计,通过遗传操作手段利用双质粒系统引入非天然氨基酸O-（2-溴乙基）-酪氨酸（O-（2-bromoethyl）-tyrosine,O2beY）并与引入半胱氨酸的胶原蛋白进行硫醚键的交联,为纤维蛋白的组装提供基础。具体内容分为以下四个部分:（1）引入非天然氨基酸共价键辅助胶原交联的设计策略。首先,以来源于S.pyogenes的胶原蛋白三股螺旋区片段B为对象,在其N端、C端、中间以及两端利用双质粒体系经遗传操作引入非天然氨基酸O2beY,分别表示为V-NZ、V-CZ、V-MZ和V-2Z,并在片段B两端设计引入半胱氨酸,以V-2C表示。在体外将带有O2beY和2C的重组胶原蛋白进行反应,通过形成的硫醚键辅助胶原蛋白的交联。并将此策略应用于三股螺旋全长区,分别设计两端引入O2beY的V-SC12-2Z及两端引入半胱氨酸的V-SC12-2C,进一步增大胶原蛋白溶液中的分子粒径,获得更大尺度的胶原纤维;（2）引入O2beY的重组胶原蛋白的表达优化。为获得高纯度含O2beY的重组胶原蛋白,以V-NZ为例对双质粒表达系统的阿拉伯糖浓度、诱导温度和时间以及IPTG浓度进行优化。结果表明在25℃下,以终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG和0.06%的阿拉伯糖诱导24 h可获得高纯度的重组胶原蛋白V-NZ,产量约为20.0 mg·L-1。以此条件对V-CZ、V-MZ、V-2Z 进行异源表达,产量分别为 22.0、25.0、17.0 mg·L-1;（3）胶原蛋白B段突变体的交联优化和表征。为了在体外交联时保持胶原蛋白的三股螺旋结构,选用15℃作为反应温度,研究了交联反应体系pH对成键效率的影响,结果表明,在pH为9.0的NH4HCO3缓冲液中进行交联,硫醚键形成率最高。引入单个O2beY的突变体与2C交联可形成最大分子粒径达1.0 μm的聚集体,但未观察到线性纤维,且未形成水凝胶;V-2Z与V-2C交联可形成最大分子粒径达1.0μm的聚集体,且可观察到少量线性纤维,但仍未形成水凝胶;（4）胶原蛋白SC12突变体的异源表达和交联。在大肠杆菌中异源表达野生型胶原蛋白 V-SC12 及突变体 V-SC12-2Z 和 V-SC12-2C,产量分别为 58.0、45.0、50.0 mg·L-1。在 20℃下,浓度为 1.0 mmol·L-1 和 2.5 mmol·L-1 的 V-SC12-2Z 和 V-SC12-2C 的混合溶液呈胶体状态,交联48 h后可形成最大分子粒径达1.8μm的聚集体,交联7 d后可形成较长的线性纤维。