研究背景:脑缺血发生后,尽早开通闭塞的血管,恢复血液灌流,是限制和缩小梗塞面积,改善预后的关键。但再灌注往往引起脑组织损伤的进一步加重,即再灌注损伤,导致神经细胞坏死或凋亡,神经功能障碍。超早期溶栓是目前治疗脑缺血唯一有效的措施,但太短的治疗时间窗及再灌注损伤使其临床应用受到限制;降低脑组织代谢、各种神经保护剂(自由基清除剂、钙通道阻断剂等)虽然可以在一定程度上降低患者的死亡率,但存在临床疗效不确定,不良反应严重等问题,且对于改善患者的神经功能症状,效果并不理想,究其原因是并没有从根本上解决神经细胞数量减少的问题。干细胞移植治疗脑缺血受到研究者的关注。移植的神经干细胞可在缺血脑组织局部迁移、增殖,并分化成神经元部分地替代和修复受损的神经元,从而在一定程度上改善神经功能缺失症状;然而伦理学问题、来源困难及移植后的免疫排斥反应等因素限制了其临床应用。MSCs作为目前研究最广泛的成体干细胞进入了人们的视线;但MSCs在体内向神经细胞的转化效率极低及体外扩增后的成瘤风险等,使人们不得不重新审视MSCs移植在脑缺血治疗中的作用及安全性。因此,我们迫切需要寻找新的治疗脑缺血再灌注损伤的方法,以保护和修复受损神经细胞的功能。细胞因子因其获得简便、无创伤、且有潜在的抗神经细胞凋亡和促进神经再生等作用而进入研究者的视线。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是粒系造血生长因子,用于各种原因引起的中性粒细胞减少症以及动员外周血干细胞移植治疗免疫性疾病。最近研究显示,脑缺血时,G-CSF能减少梗塞面积,促进神经功能恢复,可能的机制为:1、促进神经再生;2、促进神经营养因子的分泌;3、抑制细胞凋亡;4、抑制炎症反应;5、促进血管发生等。促红细胞生成素(EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素,主要由成人肾脏和胎肝合成,用于各种原因引起的贫血,主要是肾性贫血的治疗。随着研究的深入,发现EPO还通过非造血相关效应在缺血所致脑损伤中发挥神经保护作用,可能通过:1、抑制细胞凋亡;2、减轻炎症反应;3、减少兴奋性氨基酸的毒性作用;4、抗氧化应激;5、促进神经和血管发生等。目前认为脑缺血的发病机制复杂,是多种机制、多个环节共同作用的结果,单靠某一种药物治疗,并不能达到最好的治疗效果,联合应用作用于脑缺血后不同环节的神经保护剂,进行多靶点、多环节的综合治疗,成为脑缺血神经保护研究的新方向。由于脑组织的功能极大程度上依赖于神经元的数量和质量,因此,如果采取措施,使缺血早期神经细胞的凋亡减少,最大限度的保存神经细胞的数量;同时缺血后期使神经细胞的再生增加,促进神经细胞的增殖、分化,必将有利于脑缺血再灌注损伤后的组织修复和功能恢复。因此,我们首次尝试将G-CSF和EPO联用,以细胞凋亡和神经再生为切入点,观察联合治疗对脑缺血再灌注损伤的保护作用。本课题采用乳鼠皮质神经元氧糖剥夺复糖、复氧模型和局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,研究G-CSF联合EPO治疗是否具有防治脑缺血再灌注损伤,促进神经功能恢复的效应,并探讨其可能的作用机制。本实验内容可归纳成四部分,概述如下:第一部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对乳鼠皮质神经元氧糖剥夺模型的保护作用目的:利用体外培养的乳鼠皮质神经元制备氧糖剥夺复糖、复氧(OGD/R)模型,观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对皮质神经元OGD/R后的保护作用。方法:体外培养乳鼠皮质神经元,建立氧糖剥夺(4h)复糖、复氧(24h)模型;研究不同浓度的G-CSF和EPO对皮质神经元的保护作用;研究最佳治疗浓度时,G-CSF和EPO单独或联合治疗对皮质神经元的保护作用,通过CCK-8分析测定细胞活力、LDH漏出量检测细胞损伤程度、AnnexinV/PI法测定细胞凋亡率、Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。结果:1、成功制备了乳鼠皮质神经元氧糖剥夺复糖、复氧(OGD/R)模型。2、G-CSF 0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml处理组均可提高细胞活力、降低LDH漏出量,1μg/ml保护作用最强,10μg/ml保护作用略有下降。3、EPO 1U/ml、10U/ml和100U/ml处理组均可提高细胞活力、降低LDH漏出量,10U/ml和100U/ml保护作用相似。4、G-CSF和EPO联合治疗组较各单独治疗组明显提高细胞活力、降低LDH漏出量、减少细胞凋亡率(P <0.05);与G-CSF比较,EPO的干预明显提高细胞活力、降低LDH漏出量、减少细胞凋亡率,且有统计学差异(P <0.05)。5、G-CSF和EPO联合治疗组较各单独治疗组明显增加皮质神经元Bcl-2表达、降低Caspase-3表达;与G-CSF比较,EPO的干预使Bcl-2表达增加、Caspase-3表达降低更显著(P <0.05);G-CSF和EPO单独或联合治疗均可降低Bax表达,但三个治疗组间无明显差异。结论:G-CSF可减少皮质神经元OGD/R后的细胞损伤,最佳治疗浓度为1μg/ml。EPO可减少皮质神经元OGD/R后的细胞损伤,最佳治疗浓度为10U/ml。G-CSF联合EPO明显抑制皮质神经元OGD/R后的细胞损伤,减少细胞凋亡率,增加Bcl-2的表达、降低Bax、Caspase-3的表达。EPO干预使皮质神经元凋亡减轻更明显。第二部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠的保护作用目的:通过建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,在整体水平上,观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对大鼠脑缺血再灌注后的保护作用,对联合治疗的有效性及安全性进行评价。方法:制备大脑中动脉阻断、局灶性脑缺血再灌注大鼠(I/R)模型,给予G-CSF和EPO单独或联合治疗,共5天;分别于再灌注的相应时间点进行神经功能评分、TTC染色检测梗塞面积、HE染色检测脑组织的病理改变、干湿法测定脑组织含水量、检测外周血象,实验结束时计算各组大鼠的死亡率。结果:1、成功制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,制模成功率为73.9%。2、再灌注3d、7d、14d时三个治疗组神经功能评分均高于I/R组,差异有显著性( P <0.05);7d、14d时,联合治疗组较各单独治疗组神经功能评分明显增加,均有统计学差异( P <0.05);各时间点G-CSF组和EPO组比较,神经功能评分均无明显差异。3、脑梗塞灶主要位于大脑皮质及基底节区;再灌注3d、7d时,三个治疗组梗塞面积均明显小于I/R组;联合治疗组较各单独治疗组梗塞面积明显缩小,且有统计学差异( P <0.05);各时间点G-CSF组和EPO组比较,梗塞面积均无明显差异。4、HE染色可见I/R组脑组织水肿明显,神经细胞稀疏、间隙增大、体积变小,胞核固缩,核仁不明显,缺血中心区可见核碎裂、核溶解等细胞坏死改变、出现软化坏死灶;各治疗组神经细胞损伤明显减轻,细胞坏死有所减少、组织水肿减轻。5、I/R组大鼠于再灌注后体重明显下降,7d时体重出现回升,以后持续增加;再灌注1d、3d时三个治疗组与I/R组比较体重无明显差异,7d、14d时,三个治疗组与I/R组比较体重均有所增加(P <0.05);各时间点三个治疗组间大鼠体重均无明显差异。6、I/R组大鼠死亡率为31.91%;三个治疗组大鼠死亡率分别为20.0%、17.94%、17.94%;三个治疗组均可降低大鼠的死亡率(P <0.05),但三个治疗组间大鼠死亡率无明显差异。7、再灌注1d、3d时三个治疗组与I/R组比较脑组织含水量无明显差异,7d时三个治疗组均明显减少脑组织含水量( P <0.05);各时间点三个治疗组间脑组织含水量均无明显差异。8、各组大鼠各时间点HB、RBC、PLT均无差异;I/R组再灌注1d时WBC开始增加,7d时达到高峰,14d时有所下降;各时间点I/R组和三个治疗组间、三个治疗组间WBC均无显著性差异(P >0.05),但均显著高于对照组(P <0.05)。结论:G-CSF联合EPO治疗明显改善大鼠的神经功能症状、减少梗塞面积、减轻脑组织病理改变、降低大鼠死亡率,对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。短期内联合使用G-CSF和EPO,对大鼠的血液指标未见显著影响,所用药物剂量安全。第三部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡影响的研究目的:观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法:分别于再灌注1d、3d、7d时,TUNEL染色检测各组大鼠缺血周围脑组织凋亡神经细胞数;免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达;Western-blot法检测p-Akt活性。结果:1、I/R组1d时出现大量凋亡细胞,3d时凋亡细胞数达高峰,7d时下降;再灌注1d时三个治疗组与I/R组比较凋亡细胞数无明显差异;3d、7d时三个治疗组凋亡细胞数均明显低于I/R组,联合治疗组较各单独治疗组凋亡细胞数明显减少,均有统计学差异( P <0.05);再灌注3d、7d时,与G-CSF组比较,EPO组凋亡细胞数明显减少(均P <0.05)。2、G-CSF和EPO联合治疗组较各单独治疗组均可明显增加脑组织Bcl-2的表达、降低Caspase-3的表达;与G-CSF组比较,EPO组Bcl-2表达增加、Caspase-3表达降低更明显,且有统计学差异(P <0.05);与I/R组比较,G-CSF和EPO单独或联合治疗均可降低脑组织Bax表达,但三个治疗组间Bax表达无明显差异。3、I/R组脑组织p-Akt活性明显升高;与I/R组比较,三个治疗组均可增加p-Akt的活性,联合治疗组较各单独治疗组p-Akt的活性明显增加(P <0.05);G-CSF组与EPO组比较, p-Akt活性无明显差异。结论:G-CSF联合EPO治疗显著减少缺血再灌注引起的神经细胞凋亡,增加缺血周围脑组织Bcl-2的表达、抑制Bax、Caspase-3的表达;联合治疗可能部分通过激活PI-3K/Akt途径发挥协同的抗凋亡作用。EPO在抑制神经细胞凋亡方面作用显著。第四部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠神经再生作用的研究目的:观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对脑缺血再灌注大鼠神经细胞增殖、分化及神经营养因子表达的影响。方法:通过Brdu标记增殖细胞,分别于再灌注1d、3d、7d、14d时,采用荧光单染法检测各组大鼠缺血周围脑组织Brdu阳性细胞数;免疫荧光双标法检测Brdu/NeuN、Brdu/GFAP双阳性细胞数;RT-PCR法检测神经营养因子BDNFmRNA、NGFmRNA的表达。结果:1、I/R组1d时可见散在的BrdU阳性细胞,7d时阳性细胞数达高峰,14d时下降;再灌注1d、3d时三个治疗组间及与I/R组间BrdU阳性细胞数均无明显差异;7d、14d时三个治疗组BrdU阳性细胞数均高于I/R组,联合治疗组较各单独治疗组BrdU阳性细胞数明显增加(P <0.05);再灌注7d、14d时,与EPO组比较,G-CSF组BrdU阳性细胞数明显增加(均P <0.05)。2、I/R组可见少量BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞;三个治疗组BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞数均明显高于I/R组;联合治疗组较各单独治疗组BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞数均明显增加,且有统计学差异(P <0.05);与EPO组比较,G-CSF组BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞数均明显增加( P <0.05)。3、I/R组脑组织中BDNFmRNA表达明显增加;与I/R组比较,三个治疗组BDNFmRNA表达均明显升高(P <0.05);但三个治疗组间表达无明显差异。4、I/R组脑组织中NGFmRNA表达明显增加;与I/R组比较,三个治疗组NGFmRNA表达均明显增加(P <0.05);联合治疗组较各单独治疗组NGFmRNA表达增加显著;与EPO组比较,G-CSF组NGFmRNA表达有显著增加(P <0.05)。结论:G-CSF联合EPO治疗明显促进大鼠缺血周围脑组织神经细胞的增殖,及向神经元和神经胶质细胞发生分化,同时促进神经营养因子BDNFmRNA、NGFmRNA的表达增加。G-CSF在促进神经细胞再生方面作用显著。