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核黄素在生物体内形成黄素单核苷酸FMN和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD,它们是黄素酶的辅酶。核黄素所形成的辅酶参与机体组织维生素C抗氧化作用的呼吸电子传递及氧化还原过程,参与植物抗氧化及过氧化过程,从而影响氧化性损伤及后续过敏反应过程中活性氧中间体(ROIs)的产生,而ROIs是过敏细胞坏死的重要信号,能调节生长、抗病、抗虫、抗逆,所以核黄素与植物免疫反应有关。核黄素在植物和微生物中都能自我合成,合成途径的倒数第二步是由2,4-二氧四氢喋啶合酶(lumazine synthase, LS)催化的,最后一步是由核黄素合酶(riboflavin synthase, RS)催化的。在拟南芥中发现LS与茉莉酸途径相交叉,与根对茉莉酸的敏感性、植物的抗病性密切相关。由此可推断水稻上的OsLS和OsRS很可能存在着许多不为所知的功能,在植物上关于编码这两个酶的基因的报道不多,尤其是水稻的这两个基因目前还没有得到克隆。本实验从转基因烟草中克隆到核黄素合成过程的最后一步关键酶的编码基因OsRS. OsRS,序列全长1662 bp,与Gene ID OJ1111H02.Predgene04的不含内含子和非翻译区的序列完全一致。原核表达OsRS蛋白质,对表达的目的蛋白的可溶性进行鉴定,发现OsRS基因表达产物在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式存在,经过超声波破细菌,包涵体提取,洗涤处理后用,用6mol/l盐酸胍变性溶解包涵体沉淀,能别得到包括His-tag在内的66.37 kD大小的OsRS蛋白质,分子大小与预期一致。我们将溶解的包涵体OsRS蛋白表达、纯化,通过免疫兔子制备了OsRS的多克隆抗体。利用免疫学的方法分析鉴定OsRS在烟草叶片上的亚细胞定位,再通过Western blot和免疫胶体金对OsRS的定位进行分析。实验结果表明OsRS定位于叶绿体中。硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX).是一种小分子量蛋白质,催化巯基-二硫键的交换反应,参与细胞还原环境的调节,广泛存在于植物的各种组织和器官内,在新陈代谢中有重要作用,如消除氧胁迫、参入蛋白质的转录和翻译。本研究从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRXh,并推导出NtTRXh的氨基酸序列。构建了高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.3kDa的融合蛋白,与推测的分子量一致。普通烟草中目前发现有三个h型TRX(Nicotiana tabacum thioredoxin h-like protein)基因(NtTRXh1,NtTRXh2, NtTRXh),其中的NtTRXh(AF435818)特异性的受到氧胁迫剂百草枯(Paraquat)和病毒TMV的诱导表达,据此克隆了该基因,在大原核表达NtTRXh,并用金属螯合层析(Ni柱)纯化,用纯化后的NtTRXh蛋白溶液125μg/ml注射烟草,烟草叶片中没有过敏反应现象,这说明NtTRXh本身对植物的细胞没有损害。根据TRX蛋白质催化胰岛素二硫键的性质,测定了NtTRXh的催化活性。通过序列的同源性分析发现NtTRXh具有完整的TRX蛋白质的活性位点WCGPC,属于thioredoxin h中的第三亚家族.继而我们利用PCR点突变的方法将其功能域上的两个位点分别进行单突变和双突变,得到的三个突变体(C13T,C68T,C13TC68T),并分别进行了原核表达、纯化。同时,利用上述NtTRXh活性测定方法,平行测定了NtTRXh及其三个点突变的蛋白质活性。结果表明,除活性位点WCGPC中的两个半胱氨酸残基外,N端的一个半胱氨酸残基也参与了二硫键还原的催化反应。