竹子PeD14基因克隆和内源独脚金内酯检测方法研究

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竹子从属于禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae),是典型的无性系繁殖植物类群,靠竹株基部芽眼(丛生竹)或延伸生长的地下茎侧芽(散生竹)进行更新生长。竹子地下茎侧芽的萌发和生长受到包括养分、激素在内的许多因素影响和调控,其中可溶性糖和氮磷元素是养分中重要部分,而独脚金内酯(strigolactones,SLs)是新近发现的具有抑制植物侧枝生长发育活性的一类植物激素,可能参与竹笋萌发的调控。本研究监测毛竹竹鞭及竹叶季节性养分变化,探讨竹子地下茎侧芽萌发与生长对养分的需求特征;利用外源独脚金内酯类似物处理竹子幼苗,研究竹子对SLs响应;在毛竹中克隆到一个独脚金内酯受体蛋白基因D14的同源基因PeD14,分析了其基因结构和组织表达特性;最后用超高效液相色谱(UPLC)方法测定竹子内源5-脱氧独脚金醇,初步建立了竹子中独脚金内酯的检测方法,取得主要研究结果如下:1.毛竹竹叶和竹鞭的可溶性糖含量在7月和10月均较低,1月竹叶和竹鞭的可溶性糖含量大幅增加,增幅达103.6%和52.8%,4月竹叶和竹鞭的可溶性糖含量稍微下降。竹叶和竹鞭中氮磷含量变化趋势相近,10月下降,1月稍微上升,4月又回落,除竹鞭中的磷含量变化较大外,竹叶和竹鞭的氮磷含量变化幅度相对平缓;2.外源GR24(5μM)处理绿竹(Bambusa oldhami)幼苗发现,与对照组相比,2周和4周时处理组芽平均增值数减少了95.83%和78.43%;3.通过通过同源克隆扩增得到毛竹(Phyllostachys edulis)PeD14 cDNA全长918bp序列,基因结构中含有一个内含子,编码305个氨基酸。采用实时荧光定量PCR分析PeD14基因在不同部位的表达发现,PeD14基因在芽中表达最高,鞭最少;4.PeD14拥有一个由7个β-片层组成的核心,被大约7个主要的α-螺旋围绕,其顶部是由4个α-螺旋组成的顶盖,顶盖下是一个大的疏水空腔,其中催化三联体在的位置为Ser134、Asp255和His284。毛竹PeD14基因编码的氨基酸与单子叶植物相似度>87%,与双子叶植物的D14蛋白的相似度>60%,单子叶植物在N-端比双子叶植物多34-50个不等氨基酸;5.应用超高效液相色谱法分离检测5-DS发现其最大吸收峰在237 nm,但该波长下目标峰的峰形展宽比较严重,基线发生漂移,250 nm下基线、峰形均较好,适合作为检测波长,甲醇作为流动相基线较乙腈更稳定,甲醇中添加0.25%的甲酸能改善峰形,乙酸乙酯作提取剂,利用超声辅助提取可节约前处理时间并提高提取率,固相萃取纯化可有效减少杂峰干扰。方法学考察表明该方法检出限、精密度、稳定性、重复性满足检测要求,应用该方法检测刚竹属不同竹种竹笋中5-DS含量变化为11.27~51.17 ng·g-1(FW),毛竹不同部位5-DS含量竹根>竹鞭>竹笋。
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