研究背景和目的肝细胞癌(HCC)是世界范围内普遍高发的恶性肿瘤之一,其发生率居恶性肿瘤第五位,全球每年约有新发HCC患者60万例。在中国其病死率位居恶性肿瘤的第三,仅次于胃癌和食管癌。HCC发病机制复杂,目前尚未完全明确。HCC发生的早期阶段,肝脏还保留着较大部分生理功能,临床上可以通过手术切除、肝移植或者经皮穿刺等方法得到有效治疗,并且具有理想的五年存活率。然而,由于肝细胞癌早期阶段没有明显的临床症状且缺乏特异性生物指标,而晚期阶段主要表现为肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等症状,很多肝细胞癌患者确诊时多已处在晚期阶段,预后很不理想。因此研究肝细胞癌的分子机制对探索治疗肝细胞癌的新方法至关重要。一般来说,肝细胞癌进展过程可以分为正常肝细胞分化减少、组织特异性基因的缺失、肿瘤细胞增殖加速、最后发生局部转移远处迁移。HCC患者在常规诊断前经常表现为肿瘤细胞的浸润和转移。由此可知,研究HCC细胞分化和基因调控特性具有重要的临床价值。在肝细胞癌的细胞分化和调控肝特异性基因表达过程中,有一类蛋白发挥重要作用,它们就是肝细胞核转录因子3蛋白家族(HNF-3,又名为叉头框蛋白家族)。哺乳动物中肝细胞核转录因子HNF-3包括3个基因,分别命名为HNF-3α(Foxa-1),HNF-3β(Foxa-2)和HNF-3γ(Foxa-3),它们共用相同的"翼螺旋”结构域。HNF-3β基因位于人类20号染色体短臂1区1带2亚带1次亚带(20p11.21)上,是胚肝发育过程中最早被激活的基因,已有研究表明HNF-3β表达下调与凋亡损伤密切相关。肝癌细胞系HepG2细胞中转染HNF-3β过表达质粒,细胞凋亡率降低,而转染siRNA沉默HNF-3β表达后可以增加细胞凋亡数量。但是,肝细胞癌中HNF-3β的作用机制、HNF-3p表达对临床治疗和病理预后的意义还未完全研究透彻。最近,有研究发现HNF-3β的表达和活性与其转录后水平变化异常有关。在胰腺癌细胞中,HNF-3β蛋白水平受到微小RNA(microRNA/miRNA)调控,但是miRNA并不调控HNF-3βmRNA水平。微小RNA (miRNA)是一类片段长度约为22个核苷酸的内源性非编码小RNA,广泛存在于动、植物等多种生物基因组内,主要在转录后水平发挥特异性调节靶基因表达的功能。成熟的miRNA通过与靶基因mRNA分子的3’非编码区完全或部分结合,从而抑制靶mRNA翻译成蛋白,或者诱导其降解。miRNA在生物体胚胎形成、生长发育、细胞增殖、分化、凋亡、代谢等生命活动中发挥重要的调控作用。最近的数据显示,异常表达的niRNA在多种肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色,而且直接参与肝细胞癌的生成、浸润和凋亡等多个病理过程。尽管miRNA和HNF-3β在肝细胞癌中均有异常表达,且它们的异常表达在调控肝细胞癌或肝癌细胞系中都非常重要。但是miRNA和HNF-3β的相关性目前尚未完全清楚。本研究分为以下两个部分：第一部分miR-141对HNF-3β靶向调控作用的研究一、实验目的分析HNF-3β在人肝细胞癌中的表达状况,预测并验证miR-141对HNF-3β的靶向调控作用。二、实验方法1.细胞培养人HepG2细胞的培养从液氮中取出装有HepG2细胞的冻存管,放入37℃水浴箱中至完全融化,将细胞放入9ml DMEM培养基中,混匀后1000g离心5分钟,弃上清,用含10%FBS的DMEM完全培养基重悬细胞后,将其接种于75cm培养瓶中,并置于37℃,5%CO2培养箱中,培养24h后换液,倒置显微镜下观察细胞生长情况,每2-3天用胰酶消化、传代培养,取生长状态良好的细胞用于实验。细胞转染根据实验需要,将细胞接种于6孔板或12孔板中。第二天待每孔细胞长至约50%～60%满时,分别转染等量的microRNA的前体(precursor oligonucleotides)、HNF-3β的siRNA、HNF-3β过表达质粒(HNF-3βplasmid)或者人工合成的阴性control RNA,转染媒介是Lipofectamine2000(Invitrogen)。培养24小时后收细胞提RNA用于半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR,或者培养48小时后收细胞提取蛋白质用于Western blot。2.人肝细胞癌及相应癌旁组织样本所有人肝细胞癌及其相应的癌旁组织样本(8例)均取自南方医科大学南方医院肝胆外科。3. Luciferase荧光素酶报告系统的建立和应用构建质粒首先以人的全基因组DNA为模板,用PCR扩增HNF-3βmRNA的3’-UTR,然后将PCR产物接入到荧光素酶的报告基因p-MIR-report的3’-UTR端,最后通过测序检测插入的片段,确保插入片段的正确性。荧光素酶实验首先将肝癌细胞培养在12孔板上；然后每孔用Lipofectamine2000转染lug的虫荧光素酶报告质粒和0.5ug的p-半乳糖苷酶表达载体。β-半乳糖苷酶表达载体用来做虫荧光素酶报告质粒的对照；转染24h后用荧光素酶分析试剂盒进行分析各组分的荧光值,统计分析实验结果。4. Real-Time PCR采用荧光定量PCR方法检测miR-141和HNF-3β在不同细胞系或不同组织中基因水平上的表达变化。5. Western blot通过免疫印迹Vestern blot实验检测HNF-3β在不同细胞系或不同组织中蛋白水平上的表达状况。然后通过Image J软件,对蛋白的表达状况进行定量分析(采用目的蛋白/内参蛋白)。三、实验结果1.HNF-3β在人肝细胞癌组织中的表达状况分析Western blot结果显示,相对于癌旁组织,HNF-3β在人肝细胞癌组织中表达显著增高,而HNF-3βmRNA表达无明显变化,这提示着HNF-3β可能是在转录后被调控。2.人肝细胞癌组织中miR-141与HNF-3β表达反向相关生物信息软件预测发现miR-141是HNF-3β潜在的靶miRNA,qPCR结果显示miR-141在人肝细胞癌组织中表达显著降低。同时,相关性分析还发现miR-141与HNF-3β蛋白的相关系数高于miR-141与HNF-3βmRNA,这些结果表明人肝细胞癌中miR-141与HNF-3β的表达反向相关,miR-141可能存在对HNF-3β的转录后调控。3.荧光素酶实验证明miR-141靶向调控HNF-3p细胞转染miR-141前体后HNF-3β蛋白表达显著降低,说明miR-141可能靶向作用于HNF-3β,但是仅仅从生物信息学预测和转录水平的分析并不能说明miR-141直接作用于HNF-3β。而随后的荧光素酶报告实验结果显示,野生组中转染pre-miR-141后,荧光强度显著降低,而突变组却没有变化,luciferase实验证明miR-141直接作用于HNF-3βmIRNA的3’-UTR。四、实验结论本文首次发现并证明miR-141直接作用于HNF-3β的3’-UTR,是HNF-3β的直接靶miRNA,能下调HNF-3β的表达。人肝细胞癌组织中miR-141表达降低,与肝癌组织HNF-3β高表达密切相关。第二部分miR-141靶向调控HNF-3β对肝癌细胞的增殖、侵袭和凋亡的影响研究一、实验目的探究miR-141靶向调控HNF-3β表达对肝癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响,为深入阐明肝细胞癌发生发展的分子机制提供新思路。二、实验方法1.细胞培养HepG2细胞系购自于中国生命科学研究院细胞库。采用含10%胎牛血清、1%双抗(PS)的DMEM培养基培养,置于37℃、5%的C02培养箱内。2.CCK-8细胞增殖实验取1×104/m1个细胞接种于96孔板上,待细胞长到60-70%满时,分别转染miR-141前体、siRNA、HNF-3β过表达质粒或共转染pre-miR-141和HNF-3βplasmid,培养12h、24h、36h和48h后,每孔加入10ul CCK-8继续培养1h,用酶标仪在450nnm波长处测定光密度值。每组设5个重复孔,重复3次实验。3. Transwell体外侵袭实验将饥饿的12-24h的肝癌细胞制备细胞悬液,离心弃培养基,PBS洗1-2次,用不含FBS的DMEM基础培养液重悬细胞,计数后将细胞密度调整到4×104个/ml。取200ul细胞悬液加入到Transwell上室,同时加入含10%FBS的DMEM培养基500ul到下室。37℃、5%的CO2培养箱内培养12-16h后,多聚甲醛固定30分钟,10%结晶紫室温孵育15分钟,用棉签檫去上室细胞,清水漂洗干净。Transwell小室在室温晾干后,底面朝下,置显微镜下观察、拍照并计数分析。4.细胞凋亡分析12孔板铺板,每孔1ml培养基；细胞分别转染control RNA、pre-miR-141、siRNA或HNF-3β过表达质粒等,转染6h换液2%DMEM,晚上换成无血清基础培养基过夜诱导凋亡,流式细胞实验前30分钟加H2O2(200uM)诱导凋亡。根据实验要求,准备好足够量的1×Annexin结合液和100ug/ml PI。收获的细胞用PBS洗一次,弃上清,用1×Annexin结合液重悬细胞,计数,用1×Annexin结合液稀释细胞至大约1×106/ml,为每个实验准备100ul足够体积；加5ul Alexa Fluor488Annexin V+1ul100ug/ml PI(已稀释)到每100ul细胞悬液中；细胞室温避光孵育15分钟,然后在流式细胞仪上检测细胞凋亡。三、实验结果1.miR-141靶向下调HNF-3p可抑制肝癌细胞的增殖能力肝癌细胞中过表达miR-141后发现细胞增殖数目显著减少,而干扰HNF-3β后得到相似的结果,提示miR-141通过下调HNF-3β表达而抑制细胞增殖。另外,过表达HNF-3β后细胞增殖明显增加,而恢复实验的结果显示：miR-141和HNF-3β共转染能够逆转miR-141对细胞增殖的抑制功能。2.miR-141靶向下调HNF-3β可抑制肝癌细胞的侵袭能力与对照组相比,miR-141过表达组侵袭比例显著降低,提示miR-141可通过下调HNF-3β表达而降低细胞侵袭率。恢复实验的结果显示：miR-141和HNF-3β共转染能够逆转miR-141对细胞侵袭能力的抑制作用。3.miR-141靶向下调HNF-3β可促进肝癌细胞的凋亡与对照组相比,miR-141过表达组和HNF-3β干扰组中细胞凋亡百分比显著增高,而共转染miR-141和HNF-3p能够逆转miR-141对肝癌细胞凋亡的促进作用,降低细胞凋亡数量。四、实验结论本研究发现miR-141可通过靶向下调HNF-3β表达,抑制肝癌细胞的增殖、侵袭,并促进肝癌细胞的凋亡。